杜文凱 袁素霞 胡鳳榮

（1. 南京林業(yè)大學風景園林學院，南京 210037；2. 中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

百合（Liliumspp.）為我國栽培歷史悠久的藥、食、賞多用途植物，世界五大鮮切花之一。隨著現(xiàn)代分子生物學的不斷發(fā)展，百合花色［1］、花香［2］、發(fā)育［3］及抗性［4］等相關基因的研究都取得了較大進展，為今后百合分子育種奠定了良好基礎［5］。

前人對百合基因功能研究中，基因表達分析占據(jù)了重要地位［6］。實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）是一種快速檢測基因表達量的方法，因其具有高通量、高靈敏和實時檢測等特點，目前被廣泛應用于植物基因表達水平研究中［7-8］。盡管qRT-PCR操作簡單，但qRT-PCR的準確性卻受多方面因素影響，如引物特異性、反應體系和RNA質量等［9-12］。RNA樣本中基因組DNA殘留對后期基因表達分析的準確性具有很大影響，殘留的基因組DNA一方面會影響RNA濃度的精確定量；另一方面，殘留的DNA也會影響qRT-PCR擴增效率［13］。目前，常采用設計跨內含子引物的方法來避免基因組DNA殘留對供試基因表達結果的影響［14-16］。但是很多物種的基因組測序尚未開展，很難將所有待研究基因的引物都設計為跨內含子引物［17］。因此，為了保證qRT-PCR結果的準確性，獲得高質量且無基因組DNA殘留的總RNA樣本是非常必要的。

目前，市面上RNA提取試劑盒和第一鏈cDNA合成試劑盒種類繁多。雖然大部分RNA提取試劑盒中都包含有DNA去除步驟，但DNA是否去除干凈無法得知。此外，為了避免總RNA樣本中有殘留的基因組DNA污染，部分第一鏈cDNA合成試劑盒中也加入了基因組DNA去除步驟，但cDNA質量無法預知。因此，為了檢測總RNA和cDNA樣本中基因組DNA殘留是否去除干凈，本研究從前期得到的轉錄組數(shù)據(jù)（尚未發(fā)表）中篩選了1個高度保守的持家基因TIP41-like，擬針對其內含子序列設計引物，以期可簡便快捷的檢測百合總RNA以及cDNA樣本中有無基因組DNA殘留，為后續(xù)相關基因表達分析的準確性奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試材料為岷江百合（Lilium regale）組織培養(yǎng)植株，保存于中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所組培室。隨機選取6株生長發(fā)育一致的組培苗，分別取其葉片，經(jīng)液氮速凍后，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 選擇3種不同公司生產的RNA提取試劑盒（分別標記為A、B、C，均含有基因組DNA去除步驟）用于提取岷江百合葉片RNA。采用2種不同公司品牌的第一鏈cDNA合成試劑盒（分別標記為Ⅰ、Ⅱ；Ⅰ不含有基因組DNA去除步驟，Ⅱ含有基因組DNA去除步驟）用于合成cDNA。

1.2 方法

1.2.1 含內含子的DNA序列擴增 從岷江百合轉錄組數(shù)據(jù)（尚未公布）中獲得了持家基因TIP41-like的一段mRNA序列，利用DNAMAN 5.0軟件將其序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中所有物種的TIP41-like基因組序列進行比對，推測該岷江百合TIP41-like部分序列對應的基因組DNA序列中含有2個內含子，并使用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)此段序列設計DNA擴增產物中含2個內含子的引物 ：F：5′-CCGAAAATCAGGGTAGGGTG-3′及 R ：5′-CGAAGCCAGAAACGGAGAAGA-3′。引物由上海生工生物公司合成。

以岷江百合葉片DNA為模板進行PCR擴增，PCR 反應體系20 μL ：模版DNA 2 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，2×Taq PCR Magic Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。

PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30秒，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸5 min。反應結束后，取6 μL產物用2%瓊脂糖凝膠電泳并觀察拍照。

1.2.2 基因組DNA殘留檢測引物設計 將含內含子序列的DNA擴增產物送至上海生工生物公司測序，利用DNAMAN 5.0軟件對所得到的序列進行核酸拼接；將拼接好的序列與TIP41-like轉錄組mRNA序列進行比對，尋找出內含子序列。根據(jù)所獲得的TIP41-like內含子序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計基因組DNA殘留檢測引物，引物設計時應保證引物其中任意一端序列全部落在內含子序列上，引物設計完成后由上海生工生物公司合成。以岷江百合葉片DNA為模板進行PCR擴增，反應體系參照1.2.1。反應結束后，取6 μL產物用2%瓊脂糖凝膠電泳并觀察拍照。

1.2.3 RNA樣本中基因組DNA殘留檢測 通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對三種不同RNA提取試劑盒提取的岷江百合葉片的總RNA樣本進行檢測，利用Quawell Q3000超微量紫外分光光度計檢測總RNA的質量和濃度。

以3種不同RNA試劑盒提取的岷江百合葉片總RNA為模板，使用基因組DNA殘留檢測引物進行PCR擴增，PCR反應體系20 μL：模版RNA 2 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5μL，2×Taq PCR Magic Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。

PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸5 min。反應結束后，取6 μL產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察拍照。

1.2.4 cDNA中基因組DNA殘留檢測 以兩種不同公司品牌的第一鏈cDNA合成試劑盒對3種RNA提取試劑盒提取的18個RNA樣本分別進行第一鏈cDNA合成。以獲得的cDNA為模板，分別使用基因組DNA殘留檢測引物進行PCR擴增，反應體系參照1.3.3。反應結束后，取6 μL產物用2%瓊脂糖凝膠電泳并觀察拍照。

2 結果

2.1 含內含子的DNA序列擴增及序列比對

以DNA為模板，使用擴增產物中含內含子的引物（F/R）進行PCR擴增，獲得了條帶單一的目的片段（圖1）。將此DNA擴增產物送上海生工生物公司測序，得到了片段大小為367 bp的堿基序列。利用DNAMAN 5.0軟件將測序獲得的DNA產物片段與轉錄組mRNA序列進行比對發(fā)現(xiàn)，此DNA擴增產物共有2段內含子序列（圖2）。

圖1 岷江百合TIP41-like含內含子DNA片段擴增結果

圖2 TIP41-like含內含子DNA片段和對應的mRNA片段序列比對結果

2.2 基因組DNA殘留檢測引物設計

根據(jù)2.1比對結果，設計了一對基因組DNA殘留檢測引物 ：LDRG-F：5′-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3′及 LDRG-R ：5′-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3′。其中LDRG-R引物全部落在內含子序列上（圖 2）。

岷江百合葉片DNA為模板，對設計的基因組DNA殘留檢測引物（LDRG-F/LDRG-R）進行PCR擴增驗證，獲得了條帶單一與預期產物長度（182 bp）結果相一致的擴增片段（圖3）。

圖3 岷江百合基因組DNA殘留檢測片段擴增結果

2.3 RNA樣本檢測

三種RNA提取試劑盒提取的總RNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖4）顯示，28S和18S rRNA條帶清晰，無雜帶和彌散現(xiàn)象。經(jīng)Quawell Q3000檢測，OD260/280在1.8-2.1范圍內，表明提取的RNA完整性好，無蛋白質污染。

使用基因組DNA殘留檢測引物（LDRGF/LDRG-R）對提取的總RNA進行檢測，結果（圖5）顯示，使用試劑盒A和B提取的12個總RNA樣本中均能擴增出條帶，且條帶清晰，表明總RNA樣本中含有較高濃度的DNA殘留。使用試劑盒C提取的總RNA樣本中未能擴增出條帶，表明此總RNA樣本中無基因組DNA殘留。

2.4 cDNA樣本中基因組DNA殘留檢測

利用第一鏈cDNA合成試劑盒Ⅰ、Ⅱ對三種RNA提取試劑盒提取的總RNA樣本分別進行反轉錄，使用基因組DNA殘留檢測引物（LDRGF/LDRG-R）對獲得的cDNA樣本進行檢測，結果（圖6）表明：兩種cDNA合成試劑盒合成的cDNA 樣本中A1-A6和B1-B6均能擴增出目的片段，C1-C6無法擴增出目的條帶，表明兩種cDNA合成試劑盒均無法去除RNA樣本中殘留的基因組DNA。

圖4 三種不同RNA提取試劑盒提取的岷江百合葉片總RNA電泳檢測結果

圖5 總RNA樣本中基因組DNA殘留檢測片段擴增結果

3 討論

RNA質量是影響qRT-PCR準確性的關鍵因素之一［18-21］，本課題組在前期qRT-PCR實驗中發(fā)現(xiàn)，待測基因的相對表達量不穩(wěn)定，推測總RNA樣本可能存在基因組DNA殘留，因此，建立一種快速高效地檢測總RNA樣本中基因組DNA殘留的方法具有重要的實踐意義。本實驗在前期得到的轉錄組數(shù)據(jù)中挖掘了一個持家基因TIP41-like，根據(jù)其部分內含子序列設計了一對基因組DNA殘留檢測引物，用于檢測總RNA和cDNA樣本中的基因組DNA殘留。

圖6 cDNA樣本中基因組DNA殘留檢測片段擴增結果

基因組DNA殘留是抑制后續(xù)實驗中反轉錄和實時熒光定量PCR反應的重要因素［22-23］。目前RNA提取過程中去除基因組DNA最常用的方法就是加入DNase Ⅰ消化［24］。本研究采用了3種不同公司生產的RNA提取試劑盒對岷江百合組培苗葉片進行了總RNA提取，通過RNA凝膠電泳和純度檢測無法得知總RNA樣本中基因組DNA是否去除干凈（圖4）。但使用基因組DNA殘留檢測引物（LDRG-F/LDRG-R）對總RNA樣本進行擴增后發(fā)現(xiàn)，盡管3種試劑盒提取過程中均含有DNA去除步驟，但是RNA質量差異較大，總RNA提取試劑盒A、B提取的RNA樣本均存在嚴重的基因組DNA污染，而試劑盒C提取的總RNA樣本無基因組DNA殘留（圖5）。

此外，部分試劑公司為了避免總RNA樣本中殘留基因組DNA，第一鏈cDNA合成試劑盒中增加了基因組DNA去除步驟。在本試驗中，盡管第一鏈cDNA合成試劑盒Ⅰ中含有基因組DNA去除步驟，但還是無法去除總RNA樣本殘留的基因組DNA（圖 6）。

目前，很多研究都是將獲得的總RNA和cDNA樣本直接用于后續(xù)試驗［25-26］，盡管市面上大多數(shù)RNA提取試劑盒和部分第一鏈cDNA合成試劑盒中都加入了基因組DNA去除步驟，但獲得的總RNA和cDNA樣本質量無法預知，因此，為了保證qRTPCR實驗的準確性，必須對提取的總RNA及cDNA樣本進行基因組DNA殘留檢測，這一點應該引起從事類似科學研究者的重視。本研究依據(jù)持家基因TIP41-like部分內含子序列設計的基因組DNA殘留檢測引物，可快速檢測岷江百合總RNA以及cDNA樣本中有無基因組DNA殘留，以確保后續(xù)待測基因表達分析的準確性，并為其他百合材料以及其他物種相關研究提供參考。

4 結論

依據(jù)轉錄組中持家基因TIP41-like的部分內含子序列設計了1對基因組DNA殘留檢測引物：LDRG-F ：5′-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3′及LDRG-R ：5′-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3′，能夠快速檢測總RNA樣本中的基因組DNA殘留。