胡贊 孫銳 程方雄 曾吉 葉俊

武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢普愛(ài)醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2腫瘤內(nèi)科（武漢430077）

胰腺癌是一種惡性程度極高的惡性腫瘤，5年生存率不足8%［1］。在我國(guó)胰腺癌引起的病死率占所有惡性腫瘤死亡原因的第6位，且發(fā)病率以每年2.3%的速度遞增［2］。細(xì)胞周期依賴(lài)激酶抑制劑 3（cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）為雙特異性蛋白磷酸酶家族成員，可使CDK1/2去磷酸化并失活［3-4］。據(jù)報(bào)道，CDKN3表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其在胰腺癌中的表達(dá)鮮有報(bào)道［3-4］。本研究旨在探討CDKN3在胰腺癌中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2010年1月至2016年6月我院及湖北省腫瘤醫(yī)院行胰腺癌根治術(shù)的初診胰腺癌患者29例，取癌組織及配對(duì)癌旁組織（距離腫瘤邊緣5 cm以上），其中男17例，女12例，平均年齡為58.2歲。所有患者術(shù)前均未接受放化療及靶向治療，且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)明確診斷。

1.2 生物信息學(xué)檢索訪問(wèn)并下載GEO數(shù)據(jù)集中胰腺癌GSE28735數(shù)據(jù)，分析CDKN3 mRNA在癌及癌旁組織表達(dá)差異性。

1.3 Western blot檢測(cè)CDKN3蛋白表達(dá)用PIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定蛋白含量。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，待封閉、洗膜后依次與一抗、二抗孵育，洗膜后曝光檢測(cè)。鼠抗人CDKN3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.4 免疫組織化學(xué)染色取手術(shù)切除的胰腺癌及癌旁組織，經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、切片、烤片、抗原修復(fù)、封閉后，依次加入一抗、二抗孵育后顯色。由兩位病理科醫(yī)師采用盲法判定陽(yáng)性。CDKN3主要定位于細(xì)胞漿，陽(yáng)性呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染吉瑪生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成CDKN3 siRNA，其序列如下5′-AAAC-CACCAGUGUUAUCAAUU-3′；對(duì)照siRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′［4］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞運(yùn)用Lipofectamine2000（invitrogen）試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成懸液，Transwell小室上室加細(xì)胞懸液及血清培養(yǎng)基各 100 μL，下室加 800 μL 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 h后取出并棄液、固定、染色，沖洗后用顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，細(xì)胞遷移率比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；CDKN3表達(dá)與臨床特征的關(guān)系分析采用Fisher精確概率檢驗(yàn)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)訪問(wèn)GEO數(shù)據(jù)集胰腺癌GSE28735數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織CDKN3 mRNA表達(dá)水平明顯高于配對(duì)癌旁組織（圖1）；生存分析結(jié)果顯示，高CDKN3表達(dá)胰腺癌患者生存期顯著低于低CDKN3表達(dá)患者（圖2），即高CDKN3表達(dá)提示預(yù)后不良。

圖1 CDKN3 mRNA在胰腺癌及配對(duì)癌旁組織表達(dá)水平Fig.1 CDKN3 expression level in pancreatic cancer tissue and adjacent tissue in database GSE28735

圖2 生存分析結(jié)果Fig.2 Survival analysis results

2.2 胰腺癌組織CDKN3蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)29例配對(duì)胰腺癌和癌旁組織中CDKN3蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，其中23例（79.3%）胰腺癌組織CDKN3蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（圖3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 4例配對(duì)的腺胰癌組織（T）及癌旁組織（N）中CDKN3蛋白表達(dá)情況Fig.3 The expression of CDKN3 in 4 paired pancreatic cancer tissues and adjacent tissues

2.3 CDKN3蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)CDKN3蛋白陽(yáng)性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞質(zhì)。免疫組化結(jié)果顯示，在29例配對(duì)組織中的21例，CDKN3在胰腺癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（圖4）。

圖4 CDKN3在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)（×400）Fig.4 Representative photographs of staining of CDKN3 protein in a pair of pancreatic cancer and adjacent tissues

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)體外運(yùn)用si-RNA敲低Panc-1胰腺癌細(xì)胞系中CDKN3的表達(dá)，使用Transwell小室檢測(cè)CDKN3敲低表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，CDKN3敲低顯著降低Panc-1胰腺癌細(xì)胞的遷移能力（P ＜0.01）（圖5）。

2.5 胰腺癌組織CDKN3表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系將29例癌組織CDKN3表達(dá)水平排序，并取高、低CDKN3表達(dá)樣本各14例，分析CDKN3表達(dá)水平與臨床特征之間的關(guān)系。結(jié)果顯示CDKN3表達(dá)水平與胰腺癌患者性別、年齡均無(wú)關(guān)；高CDKN3表達(dá)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率高、TNM分期高（P ＜ 0.05）（表1）。

3 討論

CDKN3被證實(shí)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過(guò)程［5］。研究證實(shí)，CDKN3在乳腺癌［4］、胃癌［6］、前列腺癌［7］中高表達(dá)，并通過(guò)不同的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為。CDKN3在乳腺癌中可作為原癌基因，通過(guò)靶向抑制下游PCNA、RhoA及Bcl-2的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及細(xì)胞周期［4］；此外，在胃癌細(xì)胞中敲低CDKN3可降低CDK2、CDC25A、CCNB1及CCNB2等下游基因的表達(dá)，可降低癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和黏附能力，并可誘導(dǎo)癌細(xì)胞阻滯于G0～G1期［6］；在前列腺癌中，CDKN3表達(dá)水平與患者生存率呈顯著負(fù)相關(guān)；敲低其表達(dá)可顯著促進(jìn)細(xì)胞停滯在G1期，癌細(xì)胞凋亡率升高、侵襲能力降低。

圖5 轉(zhuǎn)染CDKN3 siRNA后Panc-1細(xì)胞遷移能力變化Fig.5 Cell migration was assessed by transwell assay in Panc-1 cells after transfected with CDKN3 siRNA

表1 CDKN3在胰腺癌組織中的表達(dá)與部分臨床特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between the CDKN3 expression and the clinicopathologic features of the pancreatic cancer例

有趣的是，CDKN3在一些惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，而在另一些惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)。CDKN3被證實(shí)在肝癌［8］及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［9］中表達(dá)缺失或下調(diào)。CDKN3表達(dá)水平與肝癌的病理分期呈顯著負(fù)相關(guān)，抑制其表達(dá)可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的克隆能力及對(duì)化療藥物的耐受能力［8］。敲低CDKN3表達(dá)可導(dǎo)致p53和p21表達(dá)下調(diào)，而AKT1激酶表達(dá)上調(diào)。CDKN3可能通過(guò)AKT/P53/P21信號(hào)通路增強(qiáng)肝癌細(xì)胞生存能力［8］。

本課題組首次利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)胰腺癌組織CDKN3表達(dá)水平明顯高于配對(duì)癌旁組織；此外通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低CDKN3顯著降低胰腺癌細(xì)胞的遷移能力；最后統(tǒng)計(jì)分析得出，高CDKN3表達(dá)提示高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及高TNM分期，高表達(dá)CDKN3提示胰腺癌患者預(yù)后不良。本課題組后期擬深入探索CDKN3調(diào)控胰腺癌細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為胰腺癌的治療提供理論基礎(chǔ)。