祁崗 朱艷媚 李焱 李玉娟 羅世文 李曼

1青海省人民醫(yī)院（西寧810007）；2青海大學醫(yī)學院（西寧810016）

自身免疫性甲狀腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD）是病變部位主要發(fā)生在甲狀腺的器官特異性自身免疫性疾病［1］，主要包括Graves病（GD）和橋本甲狀腺炎（Hashimotos thyroiditis，HT）。AITD的發(fā)病機制尚未完全清楚，而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺細胞炎癥相關(guān)信號轉(zhuǎn)導異常、炎癥反應失衡與自身免疫性甲狀腺疾病有很大的關(guān)系［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)在AI組織中，TNF-α、IL-1β、IFN-γ等炎癥因子高表達［4］，其中 TNF-α 是NF-κB 通路的激活因子和效應子，其表達變化即受到NF-κB信號通路的調(diào)控，同時反過來又去調(diào)控NF-κB通路，二者相互調(diào)控形成正反饋環(huán)，加重炎癥［5］。作為重要的炎癥信號通路，NF-κB通路在多種炎癥疾病中異常激活，與炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6-7］，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌組織及其細胞中NF-κB通路異常激活，促進甲狀腺癌的發(fā)展［8-9］，但是其在AITD發(fā)病過程中的作用并未被闡明。為此本研究將以NF-κB通路作為基礎(chǔ)，研究自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病的分子機制，為臨床治療AITD提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料昆明小鼠，清潔級，雌性，6～8周，體質(zhì)量18～22 g，購買自蘭州大學動物實驗中心，許可證號：SYXK（甘）2015-0005。CBA/j小鼠，清潔級，雌性，5～6周，體質(zhì)量16～20 g，購買自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004。

上述小鼠均在在相對恒定溫度和相對濕度（25～27℃、40%～50%）條件下，12 h自然采光，按照清潔級標準采用標準飼料進行飼養(yǎng)。小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，觀察無異常表現(xiàn)者即可入組進行實驗研究。該飼養(yǎng)條件貫穿整個實驗過程。標準飼料購買自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，Sephadex G-200凝膠購買自索萊寶生物科技有限公司，完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）和弗氏不完全佐劑（Freund incomplete adjuvant，F(xiàn)IA）購買自北京索萊寶生物科技公司，TNF-α ELISA試劑盒購買自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，SP9001免疫組化試劑盒、RIPA裂解液、超敏型ECL檢測試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDSPAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳液以及蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)膜液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NF-κB、IKK抗體均屬于兔單克隆抗體，皆購自Abcam公司；HRP標記的山羊抗兔IgG購買自CST公司，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購買自Takara，引物有Takara公司。引物信息：TNF-α：上游5′-CCTCTAGCCCACGTCGTAGC-3′，下游5′-AGCAATGACTCCAAAGTAGACC-3′；Bcl-2：上游5′-TGACCCGCAGCAAGAAAGTG-3′，下游 5′-ATCTGTGGAGAAGACAGCTA-3′；ICAM-1：上游 5′-GACCACGGAGCCAATTTCTCA-3′，下游5′-TCCAGTTCCCCAAGCAGTCC-3′；β-actin：上游5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游 5′-TAAAACGCA GCTCAGTAACAGTCCCG-3′。

1.2 方法

1.2.1 mTg蛋白純化將昆明小鼠的甲狀腺置于4℃預冷的0.01 mmol/L的PBS中，研磨成勻漿液后，4℃3 000 r/min，離心30 min，取上清再經(jīng)4℃10 000 g，離心1 h后，經(jīng)飽和度為42%、37%和42%硫酸銨3次沉淀，PBS重懸，4℃充分透析48 h，換液6次，去除硫酸銨，透析后凍干，進行Sephadex G-200凝膠層析純化，將純化后的收集物用蒸餾水透析，聚乙二醇20000反透濃縮，冷凍干燥，將上述方法再次進行凝膠層析。最后將mTg冷凍干燥，保存于-70℃冰箱。

1.2.2 mTg蛋白鑒定將純化的蛋白加入4×上樣緩沖液，煮沸變性后，加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離，然后用考馬斯亮藍R250染色，根據(jù)條帶的分子量鑒定是否為甲狀腺球蛋白。

1.2.3 動物飼養(yǎng)及造模參照文獻［10］進行造模：于8周齡時，將CBA/j小鼠隨機分為兩組，每組10只，其中對照組（control組）給予水+CFA，模型組（mTg組）給予100 μg/鼠的mTg+CFA皮下注射初次免疫，10周齡時模型組再給予相同mTg+FIA重復免疫1次，14周齡時處死小鼠，取血清及甲狀腺組織進行檢測，并參照HE染色結(jié)果對模型進行評價。

1.2.4 HE染色摘取甲狀腺組織，PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定1周后，經(jīng)脫水后，石蠟包埋，切成4 μm切片，進行HE染色。光鏡下觀察甲狀腺組織的炎癥細胞（包括淋巴細胞、漿細胞、嗜中性粒細胞）浸潤程度，EAT炎癥分級標準：＜1級為正常，≥ 1、＜ 2級為輕度，≥ 2、＜ 3級為中度，3～4級為重度。

1.2.5 ELISA實驗眼球取血后，將血液于室溫放置30 min，待其凝固后，3 000 r/min離心10 min，取血清，按照說明書進行ELISA實驗，450 nm波長測量各孔OD值。

1.2.6 qPCR實驗用Trizol法提取甲狀腺組織總mRNA，然后按照Takara反應試劑盒依次經(jīng)過去除基因組DNA反應、反轉(zhuǎn)錄反應和qPCR進行擴增，擴增程序為：預變性：95℃、10 min、1循環(huán)數(shù)；擴增：95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s、40循環(huán)數(shù)。

1.2.7 Western bloting實驗甲狀腺組織中加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至勻漿后，4℃放置30 min，13 000 r/min離心10 min，取一部分上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，另一部分上清加入4×上樣緩沖液，煮沸變性后，進行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)4℃孵育一抗、室溫孵育二抗、ECL發(fā)光液顯色、X醫(yī)用膠片顯影、定影等步驟，最后進行拍照分析。

1.2.8 免疫組化實驗按照SP免疫組化試劑盒說明書進行實驗。甲狀腺組織切片經(jīng)過抗原熱修復、封閉、依次孵育一抗、生物素標記的二抗、辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素后，DAB顯色液顯色，至顯色程度適宜，終止反應。蘇木素復染2 min，用自來水沖洗切片，鹽酸酒精分色，洗滌后，將切片脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后拍照分析。

1.3 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0軟件包，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白純化及鑒定由圖1可知，在純化mTg過程中，圖1A中第一個峰代表丙酮分子，單一平滑表明柱子安裝合格。第二個峰圖代表分離純化的甲狀腺球蛋白，文獻報道在甲狀腺中，甲狀腺球蛋白分子量是最大的，因此第二個峰推測即為甲狀腺球蛋白，進行收集。為驗證是否為甲狀腺球蛋白，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，圖1B中三條帶為稀釋不同濃度的收集的純化蛋白，根據(jù)分子量顯示分析為甲狀腺球蛋白且蛋白純度較高，達到實驗動物造模的要求。

圖1 甲狀腺球蛋白的純化與鑒定Fig.1 Purification and identification of thyroglobulin

2.2 病理變化與Control組相比，mTg組甲狀腺組織可見甲狀腺濾泡體積變小，數(shù)量明顯增多，形狀不規(guī)則，濾泡間壁膜增厚，細胞增多，可見大量炎癥細胞浸潤。評分后，mTg組甲狀腺組織炎癥嚴重程度均達到3級以上，可見10%～40%的甲狀腺組織被炎癥細胞取代；或超過40%的甲狀腺組織被炎癥細胞取代。見圖2。

圖2 甲狀腺組織病理變化Fig.2 Pathological changes in thyroid tissue

2.3 血清中TNF-α含量變化與對照組相比，mTg組血清中TNF-α含量顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1、圖3。

2.4 甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化與對照組相比，mTg組甲狀腺組織中TNF-α mRNA、Bcl-2 mRNA、ICAM-1 mRNA表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2、圖4。

表1 小鼠血清中TNF-α濃度變化Tab.1 Changes of TNF-α levels in mice serum ±s，ng/L

表1 小鼠血清中TNF-α濃度變化Tab.1 Changes of TNF-α levels in mice serum ±s，ng/L

注：與Control組比較，**P ＜0.01

分組Control組mTg組TNF-α 83.37±11.39 185.42±13.36**

圖3 小鼠血清中TNF-α濃度變化Fig.3 Changes of TNF-α levels in mice serum

表2 各組小鼠甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化Tab.2 Changes of TNF-α，Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue ±s

表2 各組小鼠甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化Tab.2 Changes of TNF-α，Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue ±s

注：與Control組相比，**P＜0.01

分組Control組mTg組TNF-α 1.00±0.00 2.38±0.13**Bcl-2 1.00±0.00 2.11±0.12**ICAM-1 1.00±0.00 2.24±0.13**

2.5 甲狀腺組織中NF-κB蛋白變化與對照組相比，mTg組甲狀腺組織中NF-κB蛋白表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3、圖5。

表3 各組小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白表達變化Tab.3 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue ±s

表3 各組小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白表達變化Tab.3 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue ±s

注：與Control組相比，**P＜0.01

分組Control組mTg組NF-κB 0.52±0.07 0.93±0.11**

2.6 甲狀腺組織中IKK蛋白變化與對照組相比，mTg組甲狀腺組織中IKK蛋白表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖6。

3 討論

圖4 甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化Fig.4 Changes of TNF-α，Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue

圖5 甲狀腺組織中NF-κB蛋白變化Fig.5 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue

圖6 甲狀腺組織中IKK蛋白變化Fig.6 Changes of IKK protein in thyroid tissue

為了給臨床治療提供一定的理論依據(jù)，本研究通過建造自身免疫性甲狀腺炎模型探索其發(fā)病機制，在造模過程中用CBA/j小鼠，采用多次注射mTg進行免疫的造模方法，建造自身免疫性甲狀腺炎模型。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在造模完成后，甲狀腺組織中大量炎癥細胞浸潤，導致濾泡明顯增多，體積減小，泡間壁厚度增厚，濾泡呈明顯不規(guī)則樣，可見明顯的發(fā)炎癥狀，提示造模成功。

AITD作為免疫性疾病，其發(fā)病多與免疫細胞、免疫因子及其免疫相關(guān)信號通路相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺血管中TGF-β、TNF-α、IL-1α、IL-8等炎癥因子的高表達，促進了甲狀腺的炎癥介質(zhì)、黏附分子、趨化因子和一些相關(guān)酶類的過度或持續(xù)表達［11-12］，與本研究結(jié)果一致，在自身免疫性甲狀腺疾病模型鼠血清中TNF-α含量明顯增加。TNF-α作為最重要的炎癥介質(zhì)之一，其高表達不僅導致炎癥部位細胞釋放大量炎癥介質(zhì)和趨化因子，同時激活體內(nèi)的炎癥細胞，加重炎癥［13］。TNF-α可激活體內(nèi)多條炎癥相關(guān)信號通路［13］，包括NF-κB信號通路，同時TNF-α基因含有NF-κB的特異性結(jié)合位點，即TNF-α的表達可受NF-κB的調(diào)控，因此TNF-α與NF-κB信號通路可形成正反饋環(huán)［15］，相互促進，使炎癥進一步加重。這種正反饋環(huán)在很多疾病中被發(fā)現(xiàn)，參與疾病的炎癥反應。在本研究中發(fā)現(xiàn)NF-κB在模型組小鼠甲狀腺組織中表達顯著升高，同時作為NF-κB的激活因子IKK的表達在模型組甲狀腺組織中同樣顯著升高，以上提示NF-κB信號通路在自身免疫性甲狀腺模型組織中被激活。其可能與TNF-α形成正反饋環(huán)，促進AITD的發(fā)生發(fā)展，但具體機制還需進一步實驗證實。激活的NF-κB不僅調(diào)控TNF-α的表達，同時可啟動下游與凋亡、存活、增殖、遷移等相關(guān)蛋白的表達，廣泛參與炎癥反應、免疫應答、細胞增殖和細胞凋亡等多種生理、病理過程的基因調(diào)控［16］，其中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2以及黏附遷移相關(guān)蛋白ICAM-1基因的啟動子中皆含有NF-κB轉(zhuǎn)錄因子識別結(jié)合序列，二者受NF-κB的激活調(diào)控［17-18］。已有研究表明在炎癥組織中Bcl-2高表達抑制炎癥細胞凋亡，促進細胞增殖，加重炎癥［19］，而ICAM-1在炎癥組織中高表達可促進炎癥細胞的浸潤［20］，研究發(fā)現(xiàn)在炎癥過程中血管內(nèi)皮細胞表達的ICAM-1不僅介導淋巴細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附，促使淋巴細胞向炎癥部位浸潤并釋放多種炎性因子，而且炎癥組織中炎性因子又可刺激誘導血管內(nèi)皮細胞表達ICAM-1，從而促使更多的細胞向炎癥部位遷移［21］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠甲狀腺組織中Bcl-2 mRNA、ICAM-1 mRNA高表達，提示其可促進AITD炎癥的發(fā)生、發(fā)展，并且其高表達可能是由NF-κB的異常表達造成的。

綜上可知在自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病過程中，NF-κB通路異常激活，并與TNF-α形成正反饋環(huán)導致NF-κB通路持續(xù)激活，啟動Bcl-2和ICAM-1基因表達，促使炎癥細胞增殖、浸潤至甲狀腺組織，促進AITD的發(fā)生發(fā)展。