何霞 劉銘

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒外科（四川瀘州646000）

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童常見腫瘤性疾病，起源于胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞。NB具有很高異質(zhì)性，由于腫瘤生長迅速、易轉(zhuǎn)移及惡性程度高等特點(diǎn)［1］，導(dǎo)致臨床治療效果不佳。目前NB治療主要包括手術(shù)、放療、化療、造血干細(xì)胞移植和誘導(dǎo)分化等治療手段，但出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者生存率極低［2-3］。因此，探究影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于提高生存及預(yù)后具有重要意義。

FoxOs轉(zhuǎn)錄因子家族包括FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，影響細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞分化等生物學(xué)行為，在生長發(fā)育過程中起到重要作用［4］。FoxOs家族在哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育過程中廣泛表達(dá)［5］，最新研究［6］發(fā)現(xiàn)FoxOs家族在神經(jīng)元極性發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。FoxO1功能失調(diào)在多種腫瘤疾病中均有發(fā)現(xiàn)，DONG等［7］發(fā)現(xiàn)FoxO1抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，F(xiàn)oxO1在胃癌［8］、肺癌［9］及惡性膠質(zhì)瘤［10］等腫瘤性疾病中發(fā)揮抑制侵襲轉(zhuǎn)移的功能。然而，F(xiàn)oxO1對(duì)NB侵襲轉(zhuǎn)移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響確未曾報(bào)道，同時(shí)其潛在的分子機(jī)制未知，因此本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探究FoxO1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響并揭示其機(jī)制，為NB靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32和SHSY5Y購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；DMEM/F12培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；FoxO1過表達(dá)慢病毒和FoxO1 shRNA慢病毒購自上海吉瑪公司，F(xiàn)oxO1 shRNA序列：5′-CCGGGCCTGTTATCAATCTGCTAAACTCGAGTTTAGCAGATTGATAACAGGCTTTTTG-3′。FoxO1和E-cadherin單克隆抗體購自美國abcam公司，N-cadherin、Vimentin和ZEB2單克隆抗體購自美國CST公司，GAPDH多克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32和SH-SY5Y分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基，加入100 μg/mL 的青霉素/鏈霉素，細(xì)胞置于 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每隔2～3天進(jìn)行細(xì)胞換液，待細(xì)胞生長至80%～90%密度時(shí)使用胰酶消化離心，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。FoxO1過表達(dá)和FoxO1 shRNA慢病毒預(yù)實(shí)驗(yàn)感染確定IMR-32和SH-SY5Y細(xì)胞MOI值，加入5 μg/mL的polybrene和相同病毒數(shù)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，放置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入2～3 μg/mL嘌呤霉素篩選3周，使用qRT-PCR和免疫印跡法（Western-blot）檢測FoxO1 mRNA和蛋白表達(dá)情況，確定轉(zhuǎn)染及篩選效率。

1.3 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞正常消化離心，1.0×105/孔接種于6孔板內(nèi)，調(diào)節(jié)siRNA濃度為20 μmol/L，轉(zhuǎn)染前使用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，按X-treme GENE HP siRNA Transfection Reagent說明書將無血清培養(yǎng)基、siRNA或?qū)φ战MControl siRNA及轉(zhuǎn)染試劑混合靜置15 min后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)48 h檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)胰酶消化對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為1.5×105/mL，下室加入800 μL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，上室加入200 μL無血清細(xì)胞懸液，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小室用PBS清洗后使用4%多聚甲醛固定20 min，再置于0.1%的結(jié)晶紫溶液中染色30 min，取出用PBS清洗，并用棉簽擦掉上室未穿膜的細(xì)胞，隨機(jī)挑選5個(gè)不同視野于100倍光學(xué)顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

侵襲實(shí)驗(yàn)前4～6 h使用matrigel基質(zhì)膠50 μL包被濾膜孔徑為8 μm的Transwell小室，并放置于培養(yǎng)箱。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)參照遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鋪板，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為2.0×105/mL，48 h后染色記錄并拍照。

1.5 qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)細(xì)胞正常消化離心按4.0×105/孔接種于6孔板，進(jìn)行不同細(xì)胞處理。PBS清洗細(xì)胞3遍，加入細(xì)胞裂解液并置于冰上1 min，使用上海飛捷生物RNA提取試劑盒提取不同處理總RNA，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。按照TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，mRNA表達(dá)檢測使用TaKaRa SYBR@PrimixEx TaqTMⅡ反應(yīng)體系，F(xiàn)oxO1上游引物序列為：5′-TCGTCATAATCTGTCCCTACACA-3′，下游引物序列為：5′-CGGCTTCGGCTCTTAGCAAA-3′；ZEB2上游引物序列為：5′-CAAGAGGCGCAAACAAGCC-3′，下游引物序列為：5′-GGTTGGCAATACCGTCATCC-3′。使用GAPDH作為內(nèi)參，上游引物序列為：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列為：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。mRNA的表達(dá)水平采用2-△△Ct計(jì)算方法進(jìn)行分析。

1.6 免疫印跡法（Western blot）檢測相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞胰酶消化離心后傳代，4.0×105/孔種于6孔板內(nèi)進(jìn)行不同處理。取出并棄去上清，用PBS沖洗3遍加入細(xì)胞裂解液并置于冰上靜置1 min，刮下裂解物并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，震蕩混勻30 s，冰上靜置10 min。15 000 r/min離心15 min，吸取上清總蛋白。留取5 μL定量，加入6×Loading buffer后于沸水中煮沸5 min進(jìn)行蛋白變性處理。30 μg蛋白上樣，使用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，110 V×2 h轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉將膜封閉1 h，置于特定一抗4℃搖床上孵育過夜。使用TBST洗膜液10 min×3次，置于相應(yīng)的二抗，常溫?fù)u床慢速孵育1 h，10 min×3次洗膜后使用ECL顯影液進(jìn)行顯影，目的蛋白表達(dá)量通過與內(nèi)參蛋白GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對(duì)比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)FoxO1抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力使用FoxO1過表達(dá)慢病毒感染IMR-32細(xì)胞，構(gòu)建FoxO1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過Western blot（圖1A）和qRT-PCR（圖1B）檢驗(yàn)FoxO1蛋白和mRNA表達(dá)，成功構(gòu)建FoxO1過表達(dá)細(xì)胞系。使用Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力改變（圖1C、圖1D），IMR-32細(xì)胞對(duì)照組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（187±5.438）和（278±10.343），IMR-32過表達(dá)FoxO1組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（96±7.970）和（147±9.564），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），表明FoxO1過表達(dá)抑制IMR-32細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。

圖1 IMR-32細(xì)胞系過表達(dá)FoxO1侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱Fig.1 Overexpressed FoxO1 in IMR-32 cells decreased the metastasis ability

2.2 敲低FoxO1增強(qiáng)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力使用FoxO1敲低慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞，構(gòu)建FoxO1敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過Western blot（圖2A）和qRT-PCR（圖2B）檢驗(yàn)FoxO1蛋白和mRNA表達(dá)，成功構(gòu)建FoxO1敲低細(xì)胞系。Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力改變（圖2C、圖2D），SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)照組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（81±11.232）和（197±14.890），SH-SY5Y敲低FoxO1組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（165±18.697）和（328±16.768），結(jié)果差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），說明敲低FoxO1促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

2.3 FoxO1抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化使用Western blot檢測IMR-32過表達(dá)FoxO1細(xì)胞系和SH-SY5Y敲低FoxO1細(xì)胞系上皮-間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoxO1穩(wěn)定過表達(dá)后細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化，E-cadherin蛋白水平上調(diào)而N-cadherin和Vimentin蛋白水平下調(diào)（圖3A、圖3B）；FoxO1穩(wěn)定敲低后細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，E-cadherin蛋白水平下調(diào)而N-cadherin和Vimentin蛋白水平上調(diào)（圖3C、圖3D），結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 FoxO1通過抑制ZEB2表達(dá)調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化IMR-32過表達(dá)FoxO1細(xì)胞系和SH-SY5Y敲低FoxO1細(xì)胞系檢測ZEB2 mRNA（圖4A）和蛋白（圖4B）水平變化，發(fā)現(xiàn)FoxO1抑制ZEB2 mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。為了驗(yàn)證FoxO1通過調(diào)節(jié)ZEB2影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)使用siRNA敲低SH-SY5Y細(xì)胞系ZEB2表達(dá)，使用Westernblot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZEB2敲低條件下FoxO1引起的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用減弱，提示FoxO1通過影響ZEB2表達(dá)發(fā)揮功能。

圖2 SH-SY5Y細(xì)胞系敲低FoxO1侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)Fig.2 Knock-down FoxO1 in SH-SY5Y cells increased the metastasis ability

圖3 FoxO1抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化Fig.3 FoxO1 inhibited EMT of neuroblastoma cells

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童常見的惡性腫瘤，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致臨床治療頗具困難，目前常用的手術(shù)治療、化療、放射治療及移植治療等手段仍不能有效控制腫瘤進(jìn)展，因此探究NB轉(zhuǎn)移分子機(jī)制對(duì)于提高預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義。

FoxO1蛋白在多種腫瘤中存在低表達(dá)，其上游受到PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)，下游靶向調(diào)控與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)性基因表達(dá)，F(xiàn)oxO1在胰島素/胰島素樣生長因子信號(hào)通路中發(fā)揮重要功能［11］。FoxO1含量及活性受到多種因素調(diào)節(jié)，作為轉(zhuǎn)錄因子可以被上游調(diào)控分子磷酸化，磷酸化FoxO1從胞核轉(zhuǎn)移至胞漿中，失去靶向激活下游靶基因的功能［12］。MEI等［13］發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中FoxO1/3/4通過影響PDGFRA調(diào)節(jié)NB細(xì)胞分化，本研究發(fā)現(xiàn)FoxO1在NB侵襲遷移中發(fā)揮重要功能，通過過表達(dá)和敲低NB細(xì)胞FoxO1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FoxO1過表達(dá)抑制NB侵襲遷移能力，而敲低FoxO1促進(jìn)NB侵襲遷移能力。腫瘤轉(zhuǎn)移是造成NB患者死亡的重要因素，而EMT在侵襲遷移發(fā)生過程中起到重要作用。EMT發(fā)生過程中，組織良好和連接緊密的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為組織松散和缺乏細(xì)胞連接的間質(zhì)細(xì)胞［14］，并且具有轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。本研究同時(shí)檢測上皮-間質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FoxO1抑制NB細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，而敲低FoxO1促進(jìn)NB細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，說明FoxO1在NB中作為抑癌基因調(diào)控其侵襲轉(zhuǎn)移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

圖4 FoxO1通過抑制ZEB2表達(dá)調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化Fig.4 FoxO1 regulated EMT of neuroblastoma cells through inhibiting the expression of ZEB2

ZEB2（zinc-finger E-box binding homebox 2，ZEB2）在多種腫瘤如大腸癌［15］、胃癌［16］及乳腺癌［17］等促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。ZEB2能與E-cadherin編碼基因啟動(dòng)子上的E2盒結(jié)合抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄功能［18］，從而促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。此外，研究發(fā)現(xiàn)肝癌肺轉(zhuǎn)移組織中ZEB2存在過表達(dá)，且肝癌組織中FoxO1和ZEB2表達(dá)存在明顯負(fù)相關(guān)性［7］。為了探究FoxO1抑制NB侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的分子機(jī)制，本研究檢測FoxO1對(duì)ZEB2表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoxO1過表達(dá)ZEB2表達(dá)下調(diào)而FoxO1敲低后ZEB2表達(dá)升高，提示FoxO1可能通過調(diào)節(jié)ZEB2表達(dá)發(fā)揮抑制腫瘤功能。為了研究假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)在FoxO1敲低細(xì)胞系基礎(chǔ)上再次敲低ZEB2，通過檢測上皮間質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)雙基因敲除后E-cadherin和N-cadherin變化明顯減弱，提示FoxO1通過抑制ZEB2表達(dá)發(fā)揮功能。

綜上所述，本研究率先發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證FoxO1抑制NB侵襲遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)FoxO1抑制ZEB2表達(dá)是其可能的分子機(jī)制，對(duì)于NB轉(zhuǎn)移研究提供新思路。本研究主要通過體外實(shí)驗(yàn)研究FoxO1蛋白的功能，缺乏體內(nèi)研究證據(jù)，在今后研究中會(huì)增加體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FoxO1蛋白的功能并進(jìn)一步探討其影響ZEB2表達(dá)的分子機(jī)制，有可能為轉(zhuǎn)移性NB的綜合治療帶來新的靶點(diǎn)。