馮協(xié)和，李 聰，王 珊，劉 菁

0 引言

近年來(lái)，作為糖尿病的主要并發(fā)癥之一，糖尿病腎病的發(fā)病率升高[1]。糖尿病腎病的腎臟損害包括內(nèi)部的腎小管、腎小球、腎間質(zhì)以及內(nèi)部血管病變等，隨著病變程度的加重，最終會(huì)導(dǎo)致腎臟纖維化乃至腎衰竭[2]。目前，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其發(fā)病可能是由代謝紊亂、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、遺傳和氧化應(yīng)激等多因素綜合作用的結(jié)果[3]，因此，如何延緩糖尿病腎病的進(jìn)展越來(lái)越受到關(guān)注。有報(bào)道，糖尿病腎病的特點(diǎn)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-7)的表達(dá)下降和腎小球足細(xì)胞數(shù)目和分化降低，同時(shí)，伴隨體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá)增強(qiáng)[4]。有報(bào)道，BMP-7可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞分化，從而改善腎功能，抑制腎纖維化[5]。一點(diǎn)紅為菊科植物一點(diǎn)紅Emiliasonchifolia(L.) DC的全草，味苦、性涼，具有清熱解毒、散瘀消腫的作用，主治上呼吸道感染、口腔潰瘍、肺炎、乳腺炎、腸炎、菌痢、尿路感染、瘡癤癰腫、濕疹、跌打損傷等[6]。研究表明，其可以降低鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖，改善氧化應(yīng)激，糾正糖脂代謝紊亂，保護(hù)胰島細(xì)胞[7]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究一點(diǎn)紅對(duì)STZ致糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用，及其對(duì)腎組織中TGF-β1和BMP-7表達(dá)的影響，探討一點(diǎn)紅對(duì)糖尿病模型大鼠腎臟保護(hù)作用的機(jī)制，為降糖新藥制劑的開(kāi)發(fā)及后期的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材與試劑 一點(diǎn)紅購(gòu)自神農(nóng)本草中藥飲片有限公司。厄貝沙坦片[安博維APROVEL，0.15 g，賽諾菲(杭州)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130049]；鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBB8126V)；血糖試紙條(美迪信，批號(hào)：SPF16Z5B3)；TGF-β1、BMP-7免疫組化試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。其余試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物 6～7周齡清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體重220～240 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004。飼養(yǎng)室溫度及相對(duì)濕度適宜，并且給予12 h光照和黑暗循環(huán)。自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器 BS2202S電子天平(Sartorius儀器公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，超純水系統(tǒng)(南京集水環(huán)保科技)，美迪信血糖儀(天津億朋醫(yī)療器械有限公司)，全自動(dòng)生化分析儀(南京普朗生物技術(shù)有限公司)，Sigma離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社BX51)，切片機(jī)(德國(guó)徠卡)。

2 方法

2.1 供試品的制備 稱取1 kg一點(diǎn)紅藥材置10 L 的圓底燒瓶中，加入6 L純化水，加熱回流提取2 h，過(guò)濾取續(xù)濾液，在45 ℃下減壓濃縮為黑色浸膏，冰箱冷凍儲(chǔ)存，使用時(shí)采用純化水溶解稀釋至所需灌胃量。

2.2 2型糖尿病大鼠模型建立及分組 從適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后的60只大鼠中，隨機(jī)選擇10只大鼠作為正常對(duì)照組，其余50只作為糖尿病造模動(dòng)物。正常對(duì)照組大鼠用正常普通飼料喂養(yǎng)，模型組用高糖高脂飼料喂養(yǎng)2周后，禁食12 h，腹腔注射鏈脲佐菌素溶液(35 mg/kg)進(jìn)行造模。高脂高糖飼料繼續(xù)飼養(yǎng)1周，禁食12 h，尾靜脈采血測(cè)定大鼠空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠造模成功[8]，造模成功率為72%。從造模成功的糖尿病大鼠中選取體重和血糖相當(dāng)?shù)?0只，分別作為模型組、厄貝沙坦組、一點(diǎn)紅提取物組，每組10只，模型組觀察期間死亡2只，余8只繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 給藥方法 根據(jù)分組情況，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦0.015 8 g/kg進(jìn)行灌胃(按人體每日服用0.15 g轉(zhuǎn)化為大鼠用量所得)，一點(diǎn)紅提取物組按10 g/kg進(jìn)行灌胃，正常對(duì)照組和模型組均給予等體積的純化水進(jìn)行灌胃。各組大鼠均每日灌胃1次，給藥4周。實(shí)驗(yàn)期間均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，不給予胰島素及其他降血糖干預(yù)。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 一般狀況觀察 對(duì)大鼠的一般狀況(精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、體重、毛色、進(jìn)食、飲水、排泄等)進(jìn)行觀察。

2.4.2 各組大鼠24 h的飲食量、飲水量及尿量記錄 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的前1 d,記錄各組大鼠24 h的飲食量和飲水量，采用代謝籠法收集24 h的尿液并記錄。

2.4.3 各組大鼠尿液生化指標(biāo)的測(cè)定 將實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d收集的各組大鼠的尿液，取1 ml置1.5 ml的EP管中，3 000 r/min 離心5 min后得上清液，將上清液置自動(dòng)生化測(cè)定儀中測(cè)定24 h尿蛋白總量(UPro)、24 h尿白蛋白總量(UAlb)、尿肌酐(Ucr)，采用冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀測(cè)定尿液滲透壓(UOP)。

2.4.4 各組大鼠血液生化指標(biāo)的測(cè)定 取全血經(jīng)3 000 r/min離心機(jī)離心得血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿酸(UA)、白蛋白(Alb)和三酰甘油(TG)，采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量系統(tǒng)檢測(cè)大鼠尾動(dòng)脈收縮血壓。

2.4.5 各組大鼠體重和腎臟肥大指數(shù)的測(cè)定 各組大鼠在末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，稱重后用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠后處死，迅速切取雙腎，濾紙吸干血液，天平精確稱重，計(jì)算腎臟肥大指數(shù)(Kidney hypertrophy index，KI)：KI=(腎重/體重)×100%。取部分留待腎組織病理切片和免疫組化用，其余裝于凍存管中，放置-80 ℃冰箱保存。

2.4.6 各組大鼠腎臟病理切片染色檢查 取腎組織置于10%中性甲醛固定液中24 h，分別用流水充分沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，常規(guī)病理切片，制成2 μm石蠟切片，HE、PAS染色于光鏡下觀察。

2.4.7 各組大鼠腎組織中TGF-β1和BMP-7免疫組化檢測(cè) 取部分腎組織置于10%中性甲醛固定液中48 h，分別用流水充分沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)病理切片，制成4 μm石蠟切片，70 ℃烘4 h，脫蠟入水，抗原熱修復(fù)，清除內(nèi)源性過(guò)氧化酶，滴加山羊血清封閉，分別滴加2個(gè)抗體，孵化后4 ℃過(guò)夜，在切片上滴加生物素二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，水洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。陽(yáng)性為出現(xiàn)棕黃色著色。每個(gè)切片含10個(gè)高倍視野(400×)，采用Image pro plus 6.0軟件做半定量分析，用平均吸光度值(累積吸光度/測(cè)量面積)表示TGF-β1和BMP-7的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況觀察 正常對(duì)照組大鼠飲水和進(jìn)食均比較正常，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，皮毛光澤，體重增長(zhǎng)，無(wú)死亡；模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，皮毛雜亂無(wú)光澤，體重下降，排尿增多，每日均需更換墊料，糞便稀，且飲食量和飲水量明顯增加，實(shí)驗(yàn)期間有2例死亡，可能是高血糖使多臟器衰竭致死；厄貝沙坦組與一點(diǎn)紅提取物組大鼠飲食、飲水和排泄情況較模型組均有所改善，毛色尚可，反應(yīng)能力明顯增強(qiáng)，活動(dòng)量有所增加，觀察期間均無(wú)死亡。

3.2 各組大鼠24 h飲食量、飲水量及尿量比較 與正常對(duì)照組比較，模型組、厄貝沙坦組、一點(diǎn)紅提取物組大鼠24 h的飲食量、飲水量及尿量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦組和一點(diǎn)紅提取物組大鼠24 h的飲食量、飲水量及尿量均顯著降低(P<0.05)；一點(diǎn)紅提取物組大鼠24 h的飲食量、飲水量及尿量與厄貝沙坦組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3.3 各組大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr及尿液滲透壓比較 與正常對(duì)照組比較，模型組、厄貝沙坦組、一點(diǎn)紅提取物組大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr均顯著升高(P<0.05)，UOP顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦組和一點(diǎn)紅提取物組大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr均顯著降低(P<0.05)，UOP顯著升高(P<0.05)；一點(diǎn)紅提取物組大鼠尿液中UPro、UAlb、UOP與厄貝沙坦組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但尿液中Ucr顯著高于厄貝沙坦組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠24 h飲食量、飲水量、尿量比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 各組大鼠血液中BUN、Scr、UA、Alb、TG、SBP比較 與正常對(duì)照組比較，模型組、厄貝沙坦組、一點(diǎn)紅提取物組大鼠血液中BUN、UA、TG及血壓均顯著升高(P<0.05)，僅模型組的Scr較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，厄貝沙坦組、一點(diǎn)紅提取物組的Scr與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦組、一點(diǎn)紅提取物組大鼠血液中BUN、Scr、UA、TG及SBP均顯著降低(P<0.05)；與厄貝沙坦組比較，一點(diǎn)紅提取物組僅TG顯著降低(P<0.05)，其他指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；四組間Alb比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

3.5 各組大鼠體重和腎臟肥大指數(shù)比較 模型組、厄貝沙坦組、一點(diǎn)紅提取物組大鼠的體重顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，而腎重、KI顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦組和一點(diǎn)紅提取物組大鼠的體重顯著升高(P<0.05)，腎重、KI顯著降低(P<0.05)；一點(diǎn)紅提取物組大鼠的體重、腎重和腎臟肥大指數(shù)與厄貝沙坦組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

3.6 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 通過(guò)HE、PAS染色發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠的腎臟組織中腎小球血管清晰，形態(tài)規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞數(shù)目正常，無(wú)其他明顯病變；與正常對(duì)照組相比，模型組有明顯病變發(fā)生，腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管充血擴(kuò)張，腎小球肥大，其內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、系膜細(xì)胞增生，腎小管排列紊亂；經(jīng)厄貝沙坦和一點(diǎn)紅提取物干預(yù)后，與模型組相比，兩組的腎臟病變明顯改善，腎間質(zhì)尚有散在的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)皮細(xì)胞尚有些許腫脹，系膜細(xì)胞增生已恢復(fù)正常，腎小管上皮形態(tài)正常，二者觀察無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1、圖2。

3.7 各組大鼠腎組織中TGF-β1和BMP-7免疫組化檢測(cè)分析 由圖3和表5顯示，正常對(duì)照組大鼠腎組織中TGF-β1有少量表達(dá)，而模型組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)顯著增多(P<0.05)，經(jīng)過(guò)厄貝沙坦和一點(diǎn)紅提取物分別干預(yù)后，與模型組相比較，厄貝沙坦組和一點(diǎn)紅提取物組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)顯著減少(P<0.05)，其中厄貝沙坦組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)略少于一點(diǎn)紅提取物組，但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr及尿液滲透壓比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與厄貝沙坦組比較，△P<0.05

表3 各組大鼠血液中BUN、Scr、UA、Alb、TG、SBP比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與厄貝沙坦組比較，△P<0.05

表4 各組大鼠體重、腎重、腎臟肥大指數(shù)比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖1 各組大鼠腎臟的病理變化(HE，400×)

圖2 各組大鼠腎臟的病理變化(PAS染色，400×)

圖3 各組大鼠腎組織中TGF-β1表達(dá)(400×)

由圖4和表5顯示，正常對(duì)照組大鼠腎組織中BMP-7大量表達(dá)，而模型組大鼠腎組織中BMP-7的表達(dá)顯著減少(P<0.05)，經(jīng)過(guò)厄貝沙坦和一點(diǎn)紅提取物分別干預(yù)后，與模型組相比較，厄貝沙坦組和一點(diǎn)紅提取物組大鼠腎組織中BMP-7的表達(dá)顯著增多(P<0.05)，兩者BMP-7的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 各組大鼠腎組織中BMP-7表達(dá)(400×)

表5 各組大鼠腎組織中TGF-β1、BMP-7表達(dá)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

糖尿病腎病為糖尿病所特有的并發(fā)癥，其病理改變主要為腎小球硬化、腎小球基底膜增厚以及系膜基質(zhì)的過(guò)度累積[9-11]。隨著糖尿病病程的進(jìn)展，腎臟的病變程度逐漸加重，大量累積的系膜基質(zhì)以及增厚的基底膜會(huì)擠壓、閉塞毛細(xì)血管，從而導(dǎo)致腎臟纖維化，乃至最終腎衰竭的發(fā)生，因此，對(duì)于如何延緩糖尿病腎病的進(jìn)程以及探索有效的防治手段具有十分重大的意義。

有研究報(bào)道，TGF-β1是腎臟纖維化發(fā)生的核心因子，能夠促進(jìn)腎臟細(xì)胞肥大、胞外基質(zhì)的積聚，從而導(dǎo)致腎臟纖維化[12]。BMP-7是TGF-β超家族的蛋白之一，可拮抗TGF-β1的作用，并能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)的形成和腎小管上皮細(xì)胞的分化，從而起到抗腎臟纖維化的作用[13]。由此可見(jiàn)，TGF-β1和BMP-7在腎臟纖維化的過(guò)程中有互逆的作用。正常情況下，抑制纖維化作用和促纖維化作用會(huì)形成一種動(dòng)態(tài)平衡，而當(dāng)出現(xiàn)病理改變時(shí)，這種平衡便會(huì)被打破，從而導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生。

厄貝沙坦是一種強(qiáng)效的血管緊張素Ⅱ受體抑制劑，研究表明，其能夠減少糖尿病腎病的尿蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，保護(hù)腎功能，對(duì)于延緩糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程安全有效[14-17]，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，研究一點(diǎn)紅對(duì)糖尿病大鼠的一般狀況、尿液和血液的生化指標(biāo)、腎臟病理變化以及腎組織中TGF-β1和BMP-7的表達(dá)，以探討一點(diǎn)紅對(duì)糖尿病的腎保護(hù)以及延緩腎病進(jìn)程的可能機(jī)制。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的24 h飲食量、飲水量、尿量、UPro、UAlb、Ucr、UOP、BUN、Scr、UA、TG、腎重、KI及TGF-β1和BMP-7的表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病理明顯改變，表明糖尿病大鼠的腎功能已經(jīng)嚴(yán)重減退。與模型組相比較，厄貝沙坦組與一點(diǎn)紅提取物組大鼠的24 h飲食量、飲水量、尿量均顯著降低，表明糖尿病的“三多”癥狀明顯改善；尿液中的UPro、UAlb、Ucr等指標(biāo)和血液中的SUN、Scr、UA、TG等指標(biāo)降低，以及尿液滲透壓UOP升高，均表明一點(diǎn)紅對(duì)糖尿病大鼠的腎臟具有明顯的保護(hù)作用；腎重、KI的顯著降低也表明了一點(diǎn)紅能夠顯著減輕糖尿病大鼠的腎臟肥大；同時(shí)，免疫組化后TGF-β1表達(dá)的顯著降低和BMP-7表達(dá)的顯著升高，表明一點(diǎn)紅能夠下調(diào)糖尿病腎組織中TGF-β1的表達(dá)水平，提高BMP-7的表達(dá)水平；且通過(guò)腎臟病理形態(tài)學(xué)的觀察，更直接客觀地反映了一點(diǎn)紅對(duì)糖尿病大鼠腎臟的改善作用。

此結(jié)果提示，一點(diǎn)紅對(duì)糖尿病大鼠的腎臟具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能為降低腎臟中TGF-β1的表達(dá)，同時(shí)增加BMP-7的表達(dá)，使糖尿病腎組織中TGF-β1和BMP-7的表達(dá)達(dá)到平衡狀態(tài)，從而起到對(duì)腎臟的保護(hù)作用。其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，以便為降糖新藥的開(kāi)發(fā)及后續(xù)臨床合理用藥奠定基礎(chǔ)。