吉曉劍，楊秀林，周厚榮，王文琴，許新梅

（貴州省人民醫(yī)院 急診內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

肺癌在全球范圍的發(fā)病率高居所有腫瘤的第3位[1]，而其中75%～80%屬非小細(xì)胞肺癌，患者就診時(shí)已處于晚期[2]。近年來(lái)，一系列靶向藥物和免疫藥物已在臨床上逐步應(yīng)用，顯示出良好的治療效果，但非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后仍處于較低水平，5年總體生存率僅11%[3]。因此，尋找與非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展的相關(guān)分子及潛在機(jī)制具有重要意義。

泛素特異性蛋白酶39（ubiqutin-specific protease,USP39）屬于泛素特異性蛋白酶家族成員[4]，其結(jié)構(gòu)由一個(gè)鋅指泛素結(jié)合域和一個(gè)泛素化C端水解酶域組成[5]。研究表明，USP39在mRNA前體剪接中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞中USP39的缺失將導(dǎo)致有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)完整性的缺陷，因此USP在細(xì)胞周期和增殖過(guò)程的調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[6]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，沉默腫瘤細(xì)胞中USP39的表達(dá)可在體內(nèi)和體外水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7-8]。然而USP39在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及功能，尚無(wú)研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌、癌旁組織及細(xì)胞系中USP39的表達(dá)情況，并分析其臨床相關(guān)性及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年6月-2016年12月于貴州省人民醫(yī)院接受全胸腔鏡非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)的患者腫瘤組織及癌旁組織，期間共收集患者腫瘤組織及癌旁組織85例。本研究入組患者詳細(xì)臨床病理資料見(jiàn)表1。所有入選本研究的非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)前未進(jìn)行包括放療、化療及靶向治療，術(shù)中所取腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織，經(jīng)石蠟包埋長(zhǎng)期儲(chǔ)存。本研究經(jīng)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，所有入組患者均親自簽署知情同意書(shū)，授權(quán)課題組使用其組織標(biāo)本進(jìn)行本項(xiàng)科學(xué)研究。

1.2 試劑與儀器

免疫組化試劑盒購(gòu)于福州邁新科技發(fā)展有限公司，LipoTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，USP39 NC及siRNA由美國(guó)Sigma公司合成，CCK-8試劑購(gòu)于日本同仁公司，SYBR premix Ex TaqⅡ和5x Prime Script RT master購(gòu)于日本TaKaRa公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)Annexin-V和PI試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司。4℃低溫離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)USP39蛋白在肺非小細(xì)胞肺癌及矮胖組織中表達(dá)

二甲苯脫蠟2次，100%～70%梯度酒精脫臘。檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)90 s。30 ml/L過(guò)氧化氫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。兔抗人USP39單克隆抗體（ab131244，英國(guó)Abcam公司）（1∶100）4℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入聚合物增強(qiáng)劑（美國(guó)Sigma公司），37℃孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入酶標(biāo)抗兔聚合物放大劑（美國(guó)Sigma公司），37℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine, DAB）（美國(guó) Sigma公司）顯色，蘇木素（美國(guó)Sigma公司）復(fù)染，1 ml/L鹽酸酒精分化，磷酸鹽緩沖液返藍(lán)，脫水，透明，封片。染色結(jié)果判定流程為：已染色的石蠟組織片子隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，。將呈現(xiàn)棕色或黃色的細(xì)胞定義為陽(yáng)性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，染色結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及著色程度綜合判斷。將陽(yáng)性細(xì)胞百分率＞25%、及不著色或較淡著色者判定為USP39陰性，將陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜35%、及染色呈現(xiàn)適中著色或深著色者為陽(yáng)性。免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師以雙盲的方式完成，兩者不一致的結(jié)果請(qǐng)上級(jí)病理醫(yī)師與兩人經(jīng)多鏡頭顯微鏡下討論得出一致結(jié)果。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

RNA提取采用Trizol法，Trizol購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化5 min，加含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心后棄去廢液，加入1 ml Trizol室溫裂解5 min。12 000 r/min 4℃離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。12 000 r/min 4℃離心15 min（德國(guó)Eppendorf公司）。吸取上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。12 000 r/min 4℃離心15 min。棄去上清，加入75%的乙醇1 ml，12 000 r/min 4℃離心5 min。所得沉淀加入20 μl去離子水，即為所需RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用10 μl體系，RNA定量后，取1 μl RNA，加入5× Prime Script RT master（日本 TaKaRa 公司）2 μl，7 μl去離子水。輕柔混勻后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：37℃ 15 min使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，85℃延伸5 s，置入4℃儲(chǔ)存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)USP39 mRNA的表達(dá)水平

采用日本TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ試 劑 盒 進(jìn) 行 qRT-PCR。PCR反 應(yīng) 采 用 25 μl體系，配置PCR反應(yīng)液，組分如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5 μl，USP39或 β-actin正 向 引 物1 μl，USP39或 β-actin反向引物 1 μl，實(shí)時(shí)熒光 定 量 產(chǎn) 物 2 μl， 去 離 子 水 8.5 μl。PCR 反 應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 30 s；95℃擴(kuò)增 15 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后樣品保存于4℃。USP39引物序列如下：正向5'-GGCA GTAAAACTTGAGGGTGT-3'，反向5'-TTGAAGTCTCA CGCCTACATTC-3'；β-actin引物序列如下：正向5'-C GTCTTCCCCTCCATCGT-3'，反向 5'-GAAGGTGTGGTG CCAGATTT-3'。 計(jì) 算 公 式 為：USP39相 對(duì)表達(dá)量：

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染USP39 siRNA 及NC

USP39正常對(duì)照（normal control, NC）及小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）由美國(guó)Sigma公司合成，按說(shuō)明書(shū)劑量使用DEPC水溶解USP39 NC及siRNA后，各取5 μl加入250 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，另取5 μl LipoTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）加入250 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，將兩溶液混勻，室溫反應(yīng)20 min。逐滴加入6孔板中，分別命名為USP39 NC組和USP39 siRNA組。

1.7 細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)

96孔板配置100 μl轉(zhuǎn)染USP39 NC或siRNA細(xì)胞懸液，37℃ 5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板中加入10 μl CCK-8溶液（日本同仁公司），在培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值（optical delnsity, OD）。

將轉(zhuǎn)染USP39 NC及USP39 siRNA的細(xì)胞消化后離心5 min，加入流式洗液5 ml清洗2次，1 000 r/min離心5 min，棄去廢液，加入PI及FITC-Annexin V（美國(guó)BD公司），室溫孵育20 min，上機(jī)檢測(cè)。凋亡檢測(cè)所用流式細(xì)胞儀型號(hào)為美國(guó)BD公司FACS Caliur，所得數(shù)據(jù)采用隨機(jī)自帶軟件分析。

1.8 細(xì)胞周期檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染USP39 NC及USP39 siRNA的細(xì)胞消化后離心5 min，加入流式洗液5 ml清洗2次，1000 r/min離心5 min，棄去廢液，加入PI（美國(guó)BD公司）室溫孵育20 min，上機(jī)檢測(cè)。凋亡檢測(cè)所用流式細(xì)胞儀為BD FACS Caliur（美國(guó)BD公司），所得數(shù)據(jù)采用美國(guó)Verity Software House公司Mod Fit LT軟件分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間陽(yáng)性例數(shù)差異分析采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman秩相關(guān)。計(jì)量資料3組間的比較，首先采用方差分析，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP39蛋白在非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌中USP39表達(dá)于腫瘤細(xì)胞包膜及包漿，非小細(xì)胞肺癌中USP39陽(yáng)性例數(shù)為53例（62.353%），非小細(xì)胞肺癌組織中典型USP39蛋白陽(yáng)性及陰性表達(dá)見(jiàn)圖1A、B。癌旁組織中未檢測(cè)到USP39的陽(yáng)性表達(dá)（0.000%），癌旁組織中USP39蛋白典型陰性表達(dá)見(jiàn)圖1C。兩組間USP39陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），USP39蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)較癌旁組織上調(diào)。見(jiàn)表1。

2.2 USP39的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

USP39的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者TNM分期呈正相關(guān)，而與其他病理特征無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表1。

2.3 USP39在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示USP39在正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平為（1.000±0.156），非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及H460分別為（3.513±0.374）和（4.174±0.516），3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.412，P=0.014）；A549和H460中的USP39相對(duì)表達(dá)水平高于正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞（均P＜0.05）。轉(zhuǎn)染USP39 NC的A549中USP39的表達(dá)水平為（1.000±0.087），轉(zhuǎn)染USP39 siRNA的A549中USP39的表達(dá)水平為（0.315±0.043），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.781，P=0.034）。轉(zhuǎn)染USP39 NC的H460中USP39的表達(dá)水平為（1.000±0.104），轉(zhuǎn)染USP39 siRNA的H460中USP39的表達(dá)水平為（0.273±0.032），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.975，P=0.031），USP39 siRNA組非小細(xì)胞肺癌中USP39表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染USP39 NC組降低。

圖1 USP39蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá) （×400）

表1 非小細(xì)胞肺癌患者不同臨床病理特征癌組織USP39陽(yáng)性表達(dá)率的比較

2.4 USP39對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響

USP39 NC組與 USP39 siRNA轉(zhuǎn)染后24、48、72、96及120 h的OD值比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的OD值有差異（A549：F=37.142，P=0.016；H460：F=41.421，P=0.011）；②USP NC組與USP39 siRNA組在轉(zhuǎn)染后120 h時(shí)間點(diǎn)的OD值有差異（A549：F=21.513，P=0.031；H460：F=19.451，P=0.042）。在120 h時(shí)，USP39 siRNA組時(shí)OD值低于USP39 NC組。③USP39 NC組與USP39 siRNA組的OD值變化趨勢(shì)有差異（A549：F=23.514和21.151，P=0.031和0.038）。見(jiàn)表2和圖3。

表2 轉(zhuǎn)染USP39 siRNA與NC的非小細(xì)胞肺癌增殖情況

2.5 USP39對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染USP39 siRNA組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞百分比為（24.872±3.522）和（16.324±0.423），轉(zhuǎn)染USP39 NC組非小細(xì)胞肺癌凋亡細(xì)胞百分比為（2.319±0.325）和（1.423±0.321），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A549：t=5.982，P=0.014，H460：t=3.291，P=0.034），USP39 siRNA組凋亡細(xì)胞百分比高于USP39 NC組。見(jiàn)圖2。

2.6 USP39對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期的影響

圖2 USP39的表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染USP39 siRNA組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比為（50.321±3.241）和（56.253±1.458），S期細(xì)胞百分比為（34.151±3.815）和（27.891±3.871）；轉(zhuǎn)染USP39 NC組非小細(xì)胞肺癌G1期細(xì)胞百分比為（68.182±2.357）和（72.831±1.551），S期細(xì)胞百分比為（14.721±4.124） 和（16.913±1.118）。 經(jīng)t檢 驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A549：t=4.323，P=0.023，H460：t=4.851，P=0.027），USP39 siRNA 組 G1期細(xì)胞百分比高于USP39 NC組，而S細(xì)胞百分比低于USP39 NC組。見(jiàn)圖3。

圖3 USP39的表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示，USP39蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)升高，其表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者TNM分期密切相關(guān)。而USP39在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常支氣管上皮細(xì)胞，沉默非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中USP39的表達(dá)后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡比例提高，細(xì)胞周期被阻滯于G1期。

去泛素化蛋白酶（DUBs）可介導(dǎo)生物體內(nèi)的泛素的去除和加工，在蛋白轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。目前已鑒定出近100種去泛素化酶，分為5個(gè)家族，泛素化C端水解酶家族，泛素特異性蛋白酶家族，卵巢腫瘤蛋白酶家族，JAMM motif蛋白酶家族，和MJD病蛋白酶家族[4]。USP39是泛素特異性蛋白酶家族成員，但USP39因缺乏3個(gè)重要活化位點(diǎn)的殘基而無(wú)泛素化蛋白酶活性。但USP39對(duì)于U4/U6-U5三聚體snRNA的招募至關(guān)重要，而對(duì)于三聚體snRNA穩(wěn)定性的維持卻無(wú)作用[5]。細(xì)胞中USP39的缺失將導(dǎo)致有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)完整性的缺陷，其可能的機(jī)制為USP39調(diào)控Aurora B和其他mRNA的表達(dá)水平[6]。近年來(lái)一系列研究顯示，USP39在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中亦發(fā)揮著重要的作用。在結(jié)腸癌[9]、骨肉瘤[10]中，研究發(fā)現(xiàn)USP39在腫瘤組織中的表達(dá)高于配對(duì)癌旁組織。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘研究顯示，USP39在肺癌組織中的表達(dá)上調(diào)[11]。值得注意的是，該研究?jī)H基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘證實(shí)USP39在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步深入研究在肺癌各分型中USP39的表達(dá)情況，及USP39與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。與該研究結(jié)果相符，本研究結(jié)果顯示USP39在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平高于癌旁組織和正常支氣管上皮細(xì)胞。更為重要的是，筆者的研究結(jié)果顯示USP39與非小細(xì)胞肺癌的TNM分期密切相關(guān)。以上研究結(jié)果提示，USP39可能參與調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及進(jìn)展，是潛在致癌分子。

在斑馬魚(yú)中，USP39的變異可阻滯細(xì)胞周期與G1期，并可下調(diào)rb1的表達(dá)水平[12]。近年來(lái)，一系列研究表明USP39在腫瘤中可作用致癌性分子發(fā)揮作用，USP39在乳腺癌[13-14]、肝細(xì)胞癌[8，15]和甲狀腺髓樣癌[7]中的表達(dá)水平上調(diào)。沉默USP39的表達(dá)水平可阻滯細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能的機(jī)制為USP39上調(diào)p-Cdc2并下調(diào)p-Cdc25c和p-myt1的表達(dá)[8]。沉默口腔鱗狀細(xì)胞癌中USP39的表達(dá)后，細(xì)胞增殖收到抑制，細(xì)胞周期被阻滯于S期和G1/M期，此外，沉默USP39還可通過(guò)活化Caspase-3和PARP而促進(jìn)口腔鱗狀上皮細(xì)胞凋亡[16]。更為重要的是，研究發(fā)現(xiàn)沉默人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞系95D中USP39的表達(dá)后，細(xì)胞的克隆形成能力降低，凋亡細(xì)胞比例增高[11]。與既往研究結(jié)果相符，本研究結(jié)果顯示，沉默非小細(xì)胞肺癌中USP39的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，而細(xì)胞凋亡比例則提升，細(xì)胞周期被阻滯于G1期。結(jié)合既往研究和本研究結(jié)果可更充分的證明USP39在腫瘤進(jìn)展中的致癌作用，其是極具潛力的腫瘤治療分子靶點(diǎn)。

綜上所述，USP39在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平高于癌旁組織或正常支氣管上皮細(xì)胞，USP39與非小細(xì)胞肺癌患者TNM分期密切相關(guān)，沉默非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中USP39的表達(dá)后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡比例提高，細(xì)胞周期被阻滯于G1期。提示USP39可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，可做為非小細(xì)胞肺癌生物治療研究的潛在分子靶點(diǎn)。