鄧顯倫，馮立波，徐建偉，向繼勇，夏冬

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科，四川 瀘州 646000；2.四川省中江縣人民醫(yī)院 普外科，四川 中江 618100）

2012年的數(shù)據(jù)顯示全球新發(fā)結(jié)直腸癌病例數(shù)約為140萬(wàn)[1]，為導(dǎo)致腫瘤相關(guān)性死亡最主要的原因之一[2]。因此，更深入的尋找與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的分子及潛在機(jī)制顯得有尤為迫切。泛素化羧基末端水解酶37（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37, UCH37）是去泛素化酶家族成員，其可通過(guò)從蛋白泛素連接鏈的遠(yuǎn)端亞基水解聚泛素而抑制蛋白降解[3]。研究顯示UCH37在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[4-5]。本研究擬檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本中UCH37的表達(dá)情況，并分析其臨床相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年6月-2012年12月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科接受結(jié)直腸癌根治術(shù)，術(shù)后病理顯示所切除的腫瘤組織為結(jié)腸癌或直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本77例。組織標(biāo)本收取后分為兩部分，一部分凍于液氮中供后續(xù)提取RNA用，一部分進(jìn)行石蠟包埋供免疫組織化學(xué)檢測(cè)用。入組患者在術(shù)后3個(gè)月后開(kāi)始隨訪記錄，隨訪截止時(shí)間點(diǎn)為患者死亡或至2016年7月本研究截止日。入組患者詳細(xì)臨床病理資料見(jiàn)表1。所有入選本次研究的結(jié)直腸癌患者術(shù)前未進(jìn)行包括放療、化療及靶向治療，術(shù)中所取腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織，經(jīng)液氮凍存或石蠟包埋長(zhǎng)期儲(chǔ)存。本研究已經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，所有入組患者均親自簽署知情同意書(shū)，授權(quán)課題組使用其組織標(biāo)本進(jìn)行本項(xiàng)科學(xué)研究。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱(chēng)免疫組化） 二甲苯脫蠟2次，100%～70%梯度酒精脫水。檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)90 s。30 ml/L過(guò)氧化氫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。兔抗人UCH37單克隆抗體（ab131244）（1∶100）4℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入聚合物增強(qiáng)劑，37℃孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入酶標(biāo)抗兔聚合物放大劑，37℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。DAB顯色，蘇木素復(fù)燃，1 ml/L鹽酸酒精分化，磷酸鹽緩沖液返藍(lán)，脫水，透明，封片。染色結(jié)果判定每個(gè)片子隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及著色程度。免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師以雙盲的方式完成，兩者不一致的結(jié)果請(qǐng)上級(jí)病理醫(yī)師與兩人經(jīng)多鏡頭顯微鏡下討論得出一致結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜25%或不著色及較淡著色者為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞百分率＞25%或適中著色及深著色者為陽(yáng)性。

1.2.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 RNA提取采用Trizol法，Trizol夠自于美國(guó)Sigma公司，將液氮冷凍過(guò)的組織研磨成粉末狀，加入1 ml Trizol繼續(xù)研磨至裂解呈透明狀。12 000 r/min 4℃離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。12 000 r/min 4℃離心15 min。吸取上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。12 000 r/min 4℃離心15 min。棄去上清，加入75%的乙醇1 ml，12 000 r/min 4℃離心5 min。所得沉淀加入20 μl去離子水，即為所需RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用10 μl體系，RNA定量后，取1 μl RNA，加入5× Prime Script RT master（日本 TaKaRa 公司）2 μl，7 μl去離子水。輕柔混勻后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：37℃ 15 min RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，逆轉(zhuǎn)錄酶工作；85℃ 5 s形成CDNA，置入4℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 采用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，配置PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)采用25 μl體系，組分如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5 μl，UCH37或β-actin正向鏈引物1 μl，UCH37或βactin反向鏈引物1 μl，實(shí)時(shí)定量產(chǎn)物2 μl，去離子水8.5 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃擴(kuò)增15 s，60℃ 延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后樣品置入4℃冰箱保存。UCH37引物序列：正向5'-TGTC TCATGGAAAGCGACCC-3'，反向 5'-GCCACTTGAAAA GAAAAATTAACCC-3'；β-actin引物序列：正向5'-CG TCTTCCCCTCCATCGT-3'，反向 5'-GAAGGTGTGGTGC CAGATTT-3'。計(jì)算公式為：UCH37相對(duì)表達(dá)量：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Spearman法，繪制K-M生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；影響因素的分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCH37 mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中UCH37 mRNA表達(dá)水平為（5.138±1.266），癌旁組織UCH37 mRNA的表達(dá)水平為（1.325±0.519）。兩者UCH37 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.746，P=0.043），UCH37 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。

2.2 UCH37蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平

UCH37的陽(yáng)性表達(dá)率在TNM Ⅰ和Ⅱ期患者為40.625%（13/32），TNM Ⅲ和Ⅳ期為 68.889%（31/45）。兩者間UCH37陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.104，P=0.019），UCH37蛋白在TNM Ⅲ和Ⅳ期結(jié)直腸癌患者組織中的陽(yáng)性率高于TNMⅠ和Ⅱ期結(jié)直腸癌患者。見(jiàn)圖1。

2.3 UCH37的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 UCH37蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) （×40，×200）

表1 UCH37與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

UCH37的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者血管侵襲情況（rs=5.729，P=0.019）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)（rs=4.364，P=0.04），而與其他病理特征無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表1。

2.4 UCH37的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年總生存率的關(guān)系

根據(jù)UCH37免疫組化結(jié)果，將結(jié)直腸癌患者分為UCH37陽(yáng)性組和UCH37陰性組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，UCH37陽(yáng)性組與陰性組結(jié)腸癌患者術(shù)后五年總體生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.979，P=0.049），UCH37陽(yáng)性組的結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年總體生存率低于UCH37陰性組，見(jiàn)圖2。

2.5 UCH37的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、血管侵襲及UCH37的表達(dá)水平與總體生存預(yù)期相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、血管侵襲及UCH37表達(dá)水平均為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子指標(biāo)。見(jiàn)表2。

圖2 UCH37的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年總體生存率的關(guān)系

表2 結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間影響因素的單因素及多因素分析Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型相關(guān)參數(shù)

3 討論

蛋白底物可與泛素共價(jià)性結(jié)合，而后被蛋白酶體識(shí)別并降解為小分子肽。泛素-蛋白酶體系是真核生物細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的非溶酶體途徑。去泛素化酶可水解底物蛋白上的泛素鏈之間的鏈接，從而抑制蛋白降解[6-8]。該蛋白降解調(diào)控機(jī)制參與多種的細(xì)胞生理過(guò)程，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、增殖、分化以及腫瘤發(fā)生[9-11]。UCH37是去泛素化酶家族成員，可去泛素化Ⅰ型活化型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）受體，而使其免于被蛋白酶體降解，從而上調(diào)TGF-β依賴(lài)的基因表達(dá)[12-13]。此外，UCH37也可去泛素化Smad2和Smad3，增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性，從而間接活化TGF-β1信號(hào)通路[14]。更為重要的是，沉默UCH37的表達(dá)可活化Caspase-9和Caspase-3而有效地誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，UCH37在卵巢癌中異常高表達(dá)，并可作為卵巢癌獨(dú)立判斷預(yù)后的分子指標(biāo)[16]。此外，UCH37在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，并可與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein 78, GRP78）結(jié)合而調(diào)控細(xì)胞存活[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，UCH37可通過(guò)調(diào)控Tcf7DNA的結(jié)合而活化Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[17]。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)UCH37的選擇性去泛素化酶抑制劑WP1130可介導(dǎo)在腫瘤中激活的UCH37等去泛素化酶，從而導(dǎo)致抗凋亡蛋白的表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)[18]。本研究均提示UCH37可能通過(guò)促進(jìn)某些原癌基因的表達(dá)而在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究的結(jié)果進(jìn)一步支持UCH37在腫瘤進(jìn)展中的促癌作用，本研究發(fā)現(xiàn)UCH37在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。生存分析結(jié)果也顯示UCH37高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者術(shù)后五年總體生存率低于低表達(dá)患者。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型結(jié)果進(jìn)一步顯示UCH37為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的分子指標(biāo)。提示UCH37在結(jié)直腸癌中可能作為癌基因發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與增值。