吉潔，申興斌，韓冰，張玉娟，馬志君

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.南院區(qū)病案室，2.病理科，3.婦科，4.神經(jīng)外科，河北 承德 067000）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌。其發(fā)病年齡趨向年輕化、病死率高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅女性生殖健康[1]。宮頸癌早期癥狀不典型，大部分就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)。一般認(rèn)為，宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展為持續(xù)性病變的過程（包括不典型增生-原位癌-早期清潤(rùn)癌-浸潤(rùn)癌）。自宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervicalint raepithelialneoplasia, CIN）發(fā)展至宮頸癌浸潤(rùn)癌時(shí)間約為6、7年[2]，早期檢出CIN為防治宮頸病變進(jìn)展為宮頸癌的關(guān)鍵途徑。而腫瘤發(fā)病為多基因、多因素共同作用的過程（包括原癌基因激活、抑癌基因喪失活性及DNA修復(fù)基因缺陷等）。垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor-transforming gene, PTTG）系自大鼠GH4垂體細(xì)胞內(nèi)分離的原癌基因[3]，其在組織增殖、轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生等過程中均有重要作用。且在子宮內(nèi)膜、腎上腺及卵巢等腫瘤中均呈高表達(dá)狀態(tài)，而在胸腺、睪丸以外正常組織中表達(dá)水平極低[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3）則為最早發(fā)現(xiàn)淋巴管特異性調(diào)控受體，主要表達(dá)與淋巴結(jié)管內(nèi)皮及受損血管內(nèi)皮中，同時(shí)也表達(dá)于血管內(nèi)皮形成初期階段、新生血管內(nèi)皮及腫瘤細(xì)胞內(nèi)，參與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（vascular endothelial growth factor C, VEGF-C）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化等過程[5]。而微血管密度（microvascular density, MVD）及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)則反映腫瘤新生血管生成及血流灌注的重要指標(biāo)[6]，可作為評(píng)估宮頸病變進(jìn)展的依據(jù)?；诖?，為探討腫瘤標(biāo)志物、PTTG、VEGFR-3及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在宮頸良惡性病變中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)對(duì)該院收治的98例宮頸病變患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性研究2012年3月-2016年2月該院收治且經(jīng)病理確診的97例宮頸病變患者的臨床資料。慢性宮頸炎患者20例。年齡23～54歲，平均（42.6±5.4）歲；均為患子宮脫垂、子宮腺肌瘤或子宮肌瘤在該院行子宮切除術(shù)者，無其他內(nèi)科合并癥，術(shù)后均經(jīng)病理確診為慢性宮頸炎。CIN 47例。年齡26～59歲，平均（44.3±6.2）歲，均為該院接受子宮切除術(shù)或?qū)m頸錐切術(shù)病例，無內(nèi)科合并癥，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為CIN。其中CIN Ⅰ級(jí)20例，Ⅱ級(jí)13例，Ⅲ級(jí)14例。宮頸浸潤(rùn)癌患者30例。年齡27～63歲，平均（47.6±7.1）歲，均行子宮癌根治術(shù)或全子宮切除術(shù)，術(shù)前均未進(jìn)行放化療，術(shù)后經(jīng)病理確診，國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟宮頸癌分期（FIGO）Ⅰ期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例；分化程度：高中分化20例，低分化11例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例；所有病例均有石蠟標(biāo)本及外周血標(biāo)本存檔；入院后均完成超聲檢查，有明確血流動(dòng)力學(xué)檢查資料；無其他部位原發(fā)惡性腫瘤；既往無宮頸手術(shù)史；且病例資料完整。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人PTTG多克隆抗體、兔抗人VEGFR-3多克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），免疫組織化學(xué)Max Vision試劑盒、DAB顯色試劑盒（購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），西門子Compact-XP全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑盒（購(gòu)自德國(guó)西門子公司），立鶴電熱恒溫箱（山東濰坊醫(yī)療器械廠），低溫冰箱（青島海爾電器股份有限公司），BX40F4顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），自動(dòng)脫水機(jī)、旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)（英國(guó)Shandon Thrmo公司），彩色多普勒超聲診斷儀（美國(guó)GE公司）。

1.3 方法

①腫瘤標(biāo)志物水平測(cè)定：取血液標(biāo)本，離心后分離血清備用，采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光及配套試劑盒、校準(zhǔn)液及質(zhì)控品，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定所有患者血清血清鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma, SCC）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9, CA199）、糖類抗原125（carbohydrate antigen 125,CA125） 水 平。 ② PTTG、VEGFR-3、MVD測(cè) 定：采用免疫組織化學(xué)法，取病理蠟塊，常規(guī)切片，厚度5 μm，電熱恒溫箱高溫（80℃）烘烤50 min，常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗3次，每次5 min，滴入3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次×5 min，加熱至沸騰，熱抗原修復(fù)，室溫冷卻，PBS沖洗3次，每次5 min，加正常山羊血清，37℃孵育0.5 h，滴加一抗（兔抗人PTTG多克隆抗體、兔抗人VEGFR-3多克隆抗、鼠抗人D2-40單克隆單體）50 μl于載玻片，4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，加入生物素標(biāo)記二抗（酶標(biāo)羊抗鼠/兔免疫球蛋白G復(fù)合物），室溫孵育0.5 h，PBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色5 min后終止，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，封片，鏡下觀察。③血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定：所有患者（非月經(jīng)期）術(shù)前1周均采用Logiq S6型彩色多普勒超聲診斷儀（美國(guó)GE公司）檢查血流動(dòng)力學(xué)，常規(guī)探查腹部后取截石位，探頭套避孕套，涂耦合劑，緩慢置入陰道內(nèi)，觀察內(nèi)部血流狀況，連續(xù)監(jiān)測(cè)3個(gè)穩(wěn)定周期，記錄收縮期峰值血流速度（peak systolic velocity, PSV）、舒張末期血流速度（end diastolic velocity, EDV）及血管阻力指數(shù)（resitance index, RI）。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

PTTG、VEGFR陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色，選取5個(gè)高倍視野，觀察其陽性表達(dá)情況，以陽性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞所占比例為1分：＜25%；2分：25%～50%；3分：＞50%。染色輕度：0分為不著色；1分：淺棕黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。染色結(jié)果（陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分）：陰性（-）為0分；弱陽性（+）：1、2分；中度陽性（++）：3、4分；強(qiáng)陽性（+++）：＞4分。D2-40陽性表達(dá)定位于內(nèi)皮細(xì)胞膜及胞漿、參照Weidner標(biāo)準(zhǔn)[7]，選取腫瘤微血管數(shù)量豐富區(qū)域作為觀察區(qū)，重復(fù)選取5個(gè)視野，取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多組比較進(jìn)行方差分析，組內(nèi)行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同類型宮頸病變患者腫瘤標(biāo)志物水平比較

慢性宮頸炎、CIN及宮頸浸潤(rùn)癌患者SCC、CA199及CA125水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。慢性宮頸炎患者SCC、CA199及CA125水平均低于CIN與宮頸浸潤(rùn)癌患者（P＜0.05）；CIN患者SCC、CA199及CA125水平低于宮頸浸潤(rùn)癌患者（P＜0.05）。見表 1。

2.2 不同類型宮頸病變患者PTTG、VEGFR-3表達(dá)陽性情況比較

慢性宮頸炎、CIN及宮頸浸潤(rùn)癌患者PTTG、VEGFR-3表達(dá)陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CIN、宮頸浸潤(rùn)癌患者PTTG、VEGFR-3表達(dá)陽性率高于慢性宮頸炎患者（P＜0.05）；宮頸浸潤(rùn)癌患者PTTG、VEGFR-3表達(dá)陽性率高于CIN患者（P＜0.05）。見表2和圖1、2。

表1 不同類型宮頸病變患者腫瘤標(biāo)志物水平比較（±s）

表1 不同類型宮頸病變患者腫瘤標(biāo)志物水平比較（±s）

注：1）與慢性宮頸炎比較，P ＜0.05；2）與CIN比較，P ＜0.05

組別 SCC/（ng/ml） CA199/（u/ml） CA125/（u/ml）慢性宮頸炎組（n =20） 1.15±0.14 10.11±3.79 13.06±5.14 CIN組（n =47） 3.21±1.441） 15.22±5.261） 20.89±7.881）宮頸浸潤(rùn)癌組（n =30） 11.08±3.171）2） 48.39±10.271）2） 46.51±11.021）2）F值 23.987 32.935 24.785 P值 0.000 0.000 0.000

表2 不同類型宮頸病變患者PTTG、VEGFR-3表達(dá)陽性情況比較

圖1 不同類型宮頸病變患者PTTG表達(dá) （SP×200）

圖2 不同類型宮頸病變患者VEGFR-3表達(dá) （SP×200）

2.3 不同類型宮頸病變患者M(jìn)VD、PSV、EDV及RI指標(biāo)比較

慢性宮頸炎、CIN及宮頸浸潤(rùn)癌患者M(jìn)VD、PSV、EDV及RI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。慢性宮頸炎患者M(jìn)VD低于CIN、宮頸浸潤(rùn)癌患者（P＜0.05），CIN患者M(jìn)VD低于宮頸浸潤(rùn)癌患者（P＜0.05）。CIN、宮頸浸潤(rùn)癌患者PSV、EDV均高于慢性宮頸炎患者（P＜0.05），而 RI低于慢性宮頸炎患者（P＜0.05）；宮頸浸潤(rùn)癌患者PSV、EDV高于CIN患者，而RI低于CIN 患者（P＜0.05）。見表 3。

表3 不同類型宮頸病變患者M(jìn)VD、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較 （±s）

表3 不同類型宮頸病變患者M(jìn)VD、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較 （±s）

注：1）與慢性宮頸炎比較，P ＜0.05；2）與CIN比較，P ＜0.05

組別 MVD PSV/（cm/s） EDV/（cm/s） RI慢性宮頸炎組（n =20） 7.11±1.67 30.26±7.14 6.82±1.22 1.56±0.44 CIN組（n =47） 10.27±1.561） 38.71±7.691） 10.26±2.761） 1.15±0.121）宮頸浸潤(rùn)癌組（n =30） 16.33±2.171）2） 52.64±10.261）2） 16.52±2.891）2） 0.67±0.361）2）F值 39.544 16.878 28.842 16.784 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

宮頸癌是女性常見生殖道惡性腫瘤，近年來發(fā)病趨向年輕化[8]。人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染是引起宮頸癌發(fā)病的主要原因，此外性生活提前、不良性行為等均與宮頸癌發(fā)病有關(guān)[9]。隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，癌基因在宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展中的作用日益引起臨床研究者的關(guān)注[10]。PTTG系在大鼠垂體腫瘤中克隆出的新型促腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移原癌基因，定位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂，與多類腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)[11]。PTTG基因包括5個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子，編碼200余個(gè)氨基酸，其轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位于第一外顯子區(qū)，存在多個(gè)可與轉(zhuǎn)錄因子共同作用的核苷酸序列，包含不同反應(yīng)元件序列及結(jié)合位點(diǎn)，而轉(zhuǎn)錄因子則可與上述位點(diǎn)共同作用，調(diào)節(jié)PTTG在不同組織表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，人體正常卵巢、肝臟、大腦及腎臟等組織，無PTTG表達(dá)或表達(dá)水平極低，而在胸腺、睪丸等組織則呈高表達(dá)[12]。DANG等[13]對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者病理組織PTTG表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平高于增生子宮內(nèi)膜組織及正常子宮內(nèi)膜組織。張紅平等[14]對(duì)晚期卵巢癌患者進(jìn)行癌基因篩查發(fā)現(xiàn)，卵巢癌PTTG呈高表達(dá)。但對(duì)宮頸病變患者PTTG表達(dá)情況尚少見報(bào)道。本研究選取慢性宮頸炎、CIN及宮頸浸潤(rùn)癌患者分別檢測(cè)患者宮頸組織PTTG表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性宮頸炎患者未見PTTG陽性表達(dá)，而宮頸浸潤(rùn)癌患者PTTG表達(dá)陽性率高于CIN，推測(cè)PTTG在宮頸癌發(fā)病早期即存在異常表達(dá)，在患者出現(xiàn)CIN時(shí)，PTTG表達(dá)增多，大量激活，過度表達(dá)促成宮頸癌發(fā)病。分析其機(jī)制則主要與PTTG可促進(jìn)c-myc基因轉(zhuǎn)錄，影響染色體正常分離，導(dǎo)致異倍體產(chǎn)生，增加組織突變風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)腫瘤表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。其次，PTTG蛋白含堿性區(qū)與酸性區(qū)，其中酸性區(qū)可募集多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，傳遞生長(zhǎng)刺激信號(hào)至細(xì)胞核，激活多類腫瘤基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞變性。

VEGFR-3則為VEGF-C同源受體，又稱作fms樣絡(luò)氨酸激酶4，多表達(dá)于正常組織、胚胎組織淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，系特異性淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，在傳遞內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂信號(hào)中起關(guān)鍵作用[15]。陳曉露等[16]發(fā)現(xiàn)，VEFR-C與VEGFR-3 兩者結(jié)合可導(dǎo)致受體絡(luò)氨酸磷酸化，激活促分裂原活性蛋白激酶通路，引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)淋巴管生成。有學(xué)者進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)接種VEGF-C細(xì)胞株可促進(jìn)腫瘤淋巴管生成[17]。李龍等[18]研究指出，胃癌、肺癌等易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的實(shí)體瘤患者VEGFR-3通常呈高表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)。本研究對(duì)宮頸病變患者病變組織VEGFR-3表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，宮頸浸潤(rùn)癌患者VEGFR-3表達(dá)陽性率高于CIN及慢性宮頸炎患者，推測(cè)VEGFR-3表達(dá)上升，可能增加脈管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，提升癌細(xì)胞對(duì)淋巴管的趨化作用，促進(jìn)癌細(xì)胞播散，導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至淋巴管。宮頸浸潤(rùn)癌患者M(jìn)VD及腫瘤標(biāo)志物水平SCC、CA199及CA125均高于CIN及慢性宮頸炎，且其血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)PSV、EDV均快于CIN、慢性宮頸炎，RI低于CIN、慢性宮頸炎，提示宮頸浸潤(rùn)癌患者腫瘤標(biāo)志物水平上調(diào)幅度高，MVD上升，新生血管生成增多，同時(shí)腫瘤組織血流速度加快，局部血流豐富，且腫瘤新生血管管壁薄，血管網(wǎng)紊亂，管腔不規(guī)則擴(kuò)張，引起動(dòng)靜脈瘺、血管湖形成，導(dǎo)致血流阻力降低。而慢性宮頸炎及CIN患者血管通透性低，血流阻力高，惡性程度低，提示腫瘤血管生成在宮頸組織癌變過程中有其重要作用。

綜上所述，宮頸浸潤(rùn)癌患者癌組織PTTG、VEGFR-3陽性表達(dá)率高，且腫瘤標(biāo)志物水平呈高表達(dá)，MVD上升、腫瘤新生血管生成多、血流速度快，與宮頸良性病變有差異。推測(cè)PTTG、VEGFR-3均可引起宮頸細(xì)胞表型改變，促進(jìn)癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及新生血管形成，在宮頸癌發(fā)病中有其重要的協(xié)同效應(yīng)。