陳 凡,林木貴,程亞麗,林梅西

(1． 福州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,福建 福州 350116； 2． 福建省閩中有機(jī)食品有限公司,福建 莆田 351100； 3． 閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建 漳州 363000)

0 引言

核受體超家族是一類配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,它在生物體內(nèi)廣泛分布,是多細(xì)胞生物體內(nèi)含量最豐富的幾大類轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一[1-3]. 核受體可以識(shí)別并結(jié)合特定的應(yīng)答元件,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控. 在體內(nèi),其活性可被相應(yīng)的配體小分子調(diào)節(jié),進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的生物學(xué)過程. 故核受體自身或受其調(diào)控基因的異常表達(dá)就成為了引發(fā)腫瘤在內(nèi)等多種疾病的重要因素之一[4-7].

為了快速評(píng)價(jià)核受體的功能并進(jìn)行潛在配體的篩選,哺乳動(dòng)物單雜交系統(tǒng)(也稱GAL4嵌合受體檢測(cè))被成功構(gòu)建并取得快速發(fā)展,作為細(xì)胞層面的轉(zhuǎn)錄激活測(cè)定系統(tǒng),它已廣泛應(yīng)用于核受體激動(dòng)劑/拮抗劑的檢測(cè)與分析研究中[8-12]. 該技術(shù)將核受體的配體結(jié)合域(LBD)連接于酵母GAL4轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域(DBD)之后,形成GAL4-NR-LBD融合蛋白表達(dá)序列. 再將融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒與含有GAL4特異性響應(yīng)元件的報(bào)告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞,最終通過對(duì)報(bào)告蛋白(多為熒光素酶)活性的測(cè)定,表征融合蛋白的激活程度. 為了排除無關(guān)因素的干擾,降低實(shí)驗(yàn)誤差,常用的單雜交質(zhì)粒系統(tǒng)中往往還攜帶有組成型表達(dá)的報(bào)告蛋白序列作為內(nèi)參,減少細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞健康程度、轉(zhuǎn)染效率和非特異性細(xì)胞反應(yīng)的影響,使主報(bào)告基因的結(jié)果歸一化 . 因此該技術(shù)具有速度快、成本低和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)完全量化的特點(diǎn),對(duì)結(jié)果的分析和比較極為有利.

但該系統(tǒng)在使用中并非全然無虞,傳統(tǒng)單雜交系統(tǒng)需要向供試細(xì)胞株轉(zhuǎn)染至少兩種質(zhì)粒(分別表達(dá)融合蛋白和報(bào)告蛋白). 一方面,質(zhì)粒的提取和保存過程容易因質(zhì)粒質(zhì)量差異(如斷裂和內(nèi)毒素殘留等)帶來實(shí)驗(yàn)誤差. 另一方面,雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細(xì)胞時(shí)也可能存在轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率差異,必須通過轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化予以彌補(bǔ). 相比單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)系統(tǒng)無疑具有更多的不確定性,最終對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性產(chǎn)生一定影響. 因此,本研究通過克隆pG5luc載體中的Gal4結(jié)合位點(diǎn)及下游螢火蟲熒光素酶基因,并將其插入pBind載體內(nèi),實(shí)現(xiàn)兩種質(zhì)粒的功能融合. 而后利用HEK 293T細(xì)胞,以RXRα等6種核受體為基礎(chǔ)對(duì)融合質(zhì)粒進(jìn)行功能測(cè)試和評(píng)價(jià).

1 材料與方法

1.1 菌種與細(xì)胞株

感受態(tài)細(xì)胞Trans5α(E.coliDH5α)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司,載體與片段酶切連接后按說明書所述步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化. 人胚腎細(xì)胞HEK 293T購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫,細(xì)胞培養(yǎng)使用添加10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行.

1.2 工具酶與試劑

FastPfu Fly DNA聚合酶,FlyCutBglII、BamHI、SalI、NotI限制性內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶,均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司； pBind、pG5luc質(zhì)粒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購于Promega公司； TurboFect轉(zhuǎn)染試劑購于Thermo Fisher公司； UNIQ-500無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒及4S Red Plus核酸染色劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司； DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清均為HyCloneTM品牌. 引物合成和質(zhì)粒測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行. 核受體cDNA文庫、各類激動(dòng)劑/拮抗劑由廈門大學(xué)藥學(xué)院張曉坤教授課題組饋贈(zèng).

1.3 單雜交質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建

通過如表1所示不同的引物組合(引物中的BamHI酶切位點(diǎn)以下劃線形式標(biāo)出),將pG5luc載體(見圖1(a))中的GAL4結(jié)合序列(簡稱“G”)、螢火蟲熒光素酶基因(簡稱“F”)連同位于二者上下游的兩個(gè)調(diào)控序列(上游調(diào)控序列,簡稱“U”； 下游調(diào)控序列,簡稱“S”)分別擴(kuò)增,形成不同長度的調(diào)控與功能序列組合,以BamHI酶切后連接至pBind載體(見圖1(b))中的BglII酶切位點(diǎn)處(BamHI與BglII為同尾酶). 為便于活性比較,轉(zhuǎn)化后僅篩選連接后正向引物靠近pBR3322位點(diǎn)而反向引物靠近CMV啟動(dòng)子位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化子做進(jìn)一步測(cè)序及后續(xù)研究.

表1 質(zhì)粒改造使用的引物及序列表

圖1 載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic representation of vectors

1.4 融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI的檢索信息,設(shè)計(jì)引物從cDNA文庫中分別擴(kuò)增RARα-LBD(E186-N416)、RXRα-LBD(T223-T462)、ERα-LBD(L310-H547)、GRα-LBD(T531-K777)、PPARγ-LBD(A237-L504)、Nur77-LBD(P361-F598)和LXRα-LBD(G167-V400)的DNA序列,經(jīng)SalI和NotI雙酶切后連接至載體的多克隆位點(diǎn),經(jīng)測(cè)序確認(rèn)無誤后予以保存以供后續(xù)轉(zhuǎn)染檢測(cè).

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

為盡量減少細(xì)胞聚集生長對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,研究使用48孔板作為報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)載體. 實(shí)驗(yàn)前每孔接種量約為1.2×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)約24 h,待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%后, 使用轉(zhuǎn)染試劑并按說明書要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作. 鑒于研究中各核受體LBD區(qū)長度差別不大,對(duì)構(gòu)建后質(zhì)粒的總長度影響較小,故確定雙質(zhì)粒單雜交體系轉(zhuǎn)染量為每孔80 ng[13](pBind-NR-LBD： 40 ng,pG5luc： 40 ng),單質(zhì)粒體系每孔轉(zhuǎn)染量為100 ng.

1.6 熒光素酶活性檢測(cè)

于細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)液,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加核受體對(duì)應(yīng)的激動(dòng)劑(ATRA： 0.1 μmol·L-1,ROS： 10 μmol·L-1,T09： 1 μmol·L-1,PPT： 10 μmol·L-1,DEX： 1 μmol·L-1,CD3254： 0.1 μmol·L-1)及拮抗劑(UVI3003： 0.5 μmol·L-1)后繼續(xù)培養(yǎng)18 h,最終裂解細(xì)胞,并使用多功能酶標(biāo)儀(TECAN Infinite?M200 Pro)及雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定報(bào)告基因讀數(shù).

1.7 不同單雜交體系的變異系數(shù)(CV)比較

分別在同一天(重復(fù)6次操作)和連續(xù)6周(每周復(fù)蘇、培養(yǎng)細(xì)胞后檢測(cè)一次)進(jìn)行雙質(zhì)粒和單質(zhì)粒系統(tǒng)下Nur77-LBD的活性檢測(cè). 模擬多次實(shí)驗(yàn)操作的結(jié)果,對(duì)每組每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的CV值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,比較兩種單雜交系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)精密度和重現(xiàn)性上的區(qū)別.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用Minitab v17.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較. 各圖中無共享字符的兩組均表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 功能融合質(zhì)粒的構(gòu)建與基本功能測(cè)試

分別使用pG5luc-U-F/pG5luc-S-R、pG5luc-U-F/pG5luc-F-R、pG5luc-G-F/pG5luc-S-R、pG5luc-G-F/pG5luc-F-R等4對(duì)引物組合對(duì)pG5luc載體序列進(jìn)行擴(kuò)增,通過酶切連接后獲得pBind-UGFS(8 667 bp,簡稱“UGFS”)、pBind-UGF(8 404 bp,簡稱“UGF”)、pBind-GFS(8 506 bp,簡稱“GFS”)及pBind-GF(8 243 bp,簡稱“GF”)等4種功能融合質(zhì)粒,隨后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證. 在插入序列完全正確的情況下,將核受體RXRα的LBD表達(dá)序列克隆到質(zhì)粒的MCS位點(diǎn),并對(duì)4種融合質(zhì)粒的熒光素酶本底信號(hào)進(jìn)行初步評(píng)價(jià),結(jié)果如圖2所示. 由圖2可知,與非融合質(zhì)粒組合(pBind-RXRα-LBD + pG5luc)相比,除GFS-RXRα-LBD外,其余3種質(zhì)粒本底值均較非融合質(zhì)粒組更低. GFS-RXRα-LBD由于不攜帶上游調(diào)控序列,因此難免受上游潛在啟動(dòng)子序列的影響,出現(xiàn)熒光素酶活性“泄露”現(xiàn)象,帶來較高的本底數(shù)值.

基于RXRα-LBD的不同類型質(zhì)粒激活倍數(shù)(激活后的讀數(shù)/質(zhì)粒本底讀數(shù))檢測(cè),結(jié)果如圖3所示. 由圖3中數(shù)據(jù)可知,UGFS-RXRα-LBD的激活效果與“pBind-RXRα-LBD + pG5luc”組合的效果最為接近(約為兩質(zhì)粒組合的80%),與“UGF”、“GFS”及“GF”3種質(zhì)粒的激活倍數(shù)存在顯著區(qū)別. 究其原因,“UGF”質(zhì)粒由于去除了下游調(diào)控序列,可能降低了熒光素酶mRNA的穩(wěn)定性,此情況下,即使該質(zhì)粒本底激活較低,也無法得到較高的激活倍數(shù). 對(duì)“GFS”質(zhì)粒而言,由于去除了上游調(diào)控序列,導(dǎo)致熒光素酶本底活性較高,故最終也無法觀察到理想的激活倍數(shù). 而“GF”質(zhì)粒雖然去除了全部的調(diào)控序列,表現(xiàn)出較低的本底值,但和“UGF”序列類似, 由于沒有下游調(diào)控序列的存在,導(dǎo)致其mRNA穩(wěn)定性較低,最終激活程度只能維持在較低水平. 當(dāng)向檢測(cè)體系中同時(shí)添加激動(dòng)劑和拮抗劑時(shí),各質(zhì)粒系統(tǒng)下的熒光素酶活性均顯著降低,其下調(diào)程度約為60%～80%. 總體而言,質(zhì)粒系統(tǒng)激活倍數(shù)越低,則對(duì)拮抗劑的影響越為敏感.

綜合分析圖2、3的結(jié)果,可以認(rèn)為UGFS系統(tǒng)是傳統(tǒng)雙質(zhì)粒系統(tǒng)較好的替代者,其針對(duì)激動(dòng)劑和拮抗劑的響應(yīng)與雙質(zhì)粒系統(tǒng)最為接近. 故課題組選用UGFS系統(tǒng)作為后續(xù)研究的基礎(chǔ).

圖2 不同類型質(zhì)粒的本底熒光素酶活性比較(n=4)Fig.2 Basal luciferase activity of different plasmid systems (n=4)

圖3 基于RXRα-LBD的不同類型質(zhì)粒熒光素酶活性比較(n=4)Fig.3 Comparison of luciferase activity induced by different plasmid systems based on RXRα-LBD (n=4)

2.2 不同核受體在UGFS系統(tǒng)下的激活效果

為驗(yàn)證UGFS質(zhì)粒是否適用于RXRα以外其它核受體的單雜交檢測(cè),課題組進(jìn)一步構(gòu)建了UGFS-ERα-LBD、UGFS-GRα-LBD、UGFS-RARα-LBD、UGFS-PPARγ-LBD和UGFS-LXRα-LBD等攜帶5種不同核受體LBD序列的質(zhì)粒,與UGFS-RXRα-LBD一同進(jìn)行了轉(zhuǎn)染及相關(guān)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖4所示. 根據(jù)核受體的類型不同, 6種LBD的激活倍數(shù)在8～36之間,Z因子均大于0.6,已經(jīng)能夠滿足常規(guī)檢測(cè)的需要,可以用于篩選特定核受體的激動(dòng)劑或拮抗劑.

2.3 UGFS系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)精密度測(cè)試

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí),單獨(dú)轉(zhuǎn)染一種質(zhì)粒理論上比同時(shí)轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒更容易得到精確而穩(wěn)定的結(jié)果. 為了驗(yàn)證單獨(dú)轉(zhuǎn)染UGFS質(zhì)粒是否在實(shí)驗(yàn)精密度和重復(fù)性上優(yōu)于傳統(tǒng)“pBind + pG5luc”體系,課題組構(gòu)建了pBind-Nur77-LBD與UGFS-Nur77-LBD質(zhì)粒. 由于Nur77-LBD具有自激活的特性,可以在不加入任何配體的情況下自行發(fā)揮活性[13],故其活性的產(chǎn)生僅與細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率有關(guān),排除了配體濃度的影響,適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)精密度測(cè)試,這一環(huán)節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示. 相對(duì)傳統(tǒng)體系而言,UGFS系統(tǒng)由于減少了所需轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒種類,更能夠取得精確且重復(fù)性強(qiáng)的數(shù)據(jù). 此外,不論何種重復(fù)方式,UGFS質(zhì)粒的CV值均保持在低而穩(wěn)定的水平,和雙質(zhì)粒體系相比,單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠明顯提高實(shí)驗(yàn)精度,有助于獲得更為可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

圖4 UGFS系統(tǒng)下不同核受體的激活效果比較(n=4)Fig.4 Comparison of activation effect between different nuclear receptors under UGFS system (n=4)

圖5 不同質(zhì)粒體系在實(shí)驗(yàn)中的精密度比較(n=6)Fig.5 CV comparison of different plasmid systems (n=6)

3 討論

哺乳動(dòng)物單雜交技術(shù)是核受體激動(dòng)劑/拮抗劑篩選的重要手段,由于利用了存在于酵母菌內(nèi),而非哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的GAL4轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控體系,充分保證了作為報(bào)告蛋白的熒光素酶分子只能在外源嵌合受體的作用下得到表達(dá),有效排除了細(xì)胞內(nèi)源受體或其它相關(guān)物質(zhì)的干擾,因此具有較高的信噪比和理想的實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性.

本研究在pBind載體的基礎(chǔ)上通過融入pG5luc載體的部分序列建立了pBind-UGFS哺乳動(dòng)物單雜交質(zhì)粒系統(tǒng),使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞后,經(jīng)檢驗(yàn)所得數(shù)據(jù)與雙質(zhì)粒系統(tǒng)較為接近,其激活效率可達(dá)雙質(zhì)粒系統(tǒng)的80%以上(不同核受體種類略有區(qū)別),且經(jīng)鑒定單質(zhì)粒系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重現(xiàn)性明顯優(yōu)于雙質(zhì)粒系統(tǒng). 但值得注意的是：

1) 本研究所建立的UGFS質(zhì)粒系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染量為100 ng/孔(48孔板)時(shí),轉(zhuǎn)染量及信號(hào)強(qiáng)度達(dá)最佳平衡,再行提高轉(zhuǎn)染量并不能顯著提高數(shù)據(jù)質(zhì)量,且可能因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性影響最終結(jié)果的穩(wěn)定[14]. 因此,若實(shí)際操作中采用相同條件,則可直接參考本研究的結(jié)果； 若實(shí)驗(yàn)條件不同,由于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染受轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞種類及培養(yǎng)條件(培養(yǎng)液種類、細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)時(shí)間等)的影響較大,則建議重新摸索最佳轉(zhuǎn)染量,以求獲得更為穩(wěn)定可靠的結(jié)論.

2) 本研究所用的pBind載體自身長度為6 360 bp,添加UGFS序列后,質(zhì)粒全長8 657 bp,若再將其它核受體的LBD區(qū)插入該載體,則質(zhì)粒全長可上升至9 500 bp左右,其轉(zhuǎn)染效率可能顯著降低[15-16]. 實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中,pBind-UGFS質(zhì)粒雖然能夠保證核受體LBD與熒光素酶基因達(dá)到最佳的“1/1”比例轉(zhuǎn)染[17],但仍可能因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率的下降,導(dǎo)致整體檢測(cè)靈敏度降低,最終影響所得結(jié)果. 因此,針對(duì)pBind-UGFS質(zhì)粒骨架的進(jìn)一步優(yōu)化,去除檢測(cè)的非必需序列仍是亟待解決的問題. 此外,隨著近年來新的熒光素酶蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)[18-21],將螢火蟲熒光素酶或pBind載體中的海腎熒光素酶(參比基因)替換為序列更短、化學(xué)發(fā)光活性更高的熒光素酶系統(tǒng),也是有效減少質(zhì)粒大小、提高轉(zhuǎn)染效率和檢測(cè)靈敏度的有效手段,值得進(jìn)一步深入研究.

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