尹 花 ， 賀 揚 ， 董建軍 3，， 陸 健

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；4.啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，山東 青島 266100；5.青島啤酒股份有限公司，山東 青島 266100）

作為一種低酒精度的發(fā)酵飲品，啤酒的風味是產(chǎn)品質(zhì)量的重要生命線。啤酒中的風味物質(zhì)主要包括醇類、酯類、有機酸類、酮類、醛類、呋喃類（麥芽香）、吡嗪類（麥芽香）、烯類（酒花香）、氨基酸類等，它們之間微妙的平衡關系，共同形成了啤酒的風味特征。風味物質(zhì)主要來自于以下幾個途徑：一是原料本身的風味成分，例如麥芽和酒花帶來的麥香和酒花香；二是酵母經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生的風味成分；三是加工過程中產(chǎn)生的以及后來貯存過程中新生成的風味物質(zhì)[1]。其中，酵母代謝產(chǎn)生的物質(zhì)是風味的重要組成部分，酵母利用麥汁中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，同時產(chǎn)生代謝產(chǎn)物如高級醇、酯類、雙乙酰、乙醛等。這些代謝副產(chǎn)物的種類和含量對啤酒質(zhì)量起著關鍵作用，某些物質(zhì)含量過多或過少，會造成啤酒口味缺陷，影響整體風味質(zhì)量[2-5]。

如何提高產(chǎn)品風味特色調(diào)控能力，實現(xiàn)多品類產(chǎn)品的差異化和同品類產(chǎn)品的一致性，成為制約規(guī)?；【菩袠I(yè)提升核心競爭力、產(chǎn)業(yè)升級的關鍵共性難題。啤酒風味調(diào)控的研究雖然經(jīng)歷了從粗放的傳統(tǒng)經(jīng)驗式調(diào)整到發(fā)酵工藝與產(chǎn)品風味的關聯(lián)研究，風味調(diào)控能力得到了極大提升，但由于工業(yè)化Lager酵母關鍵風味物質(zhì)代謝機制等基礎研究的缺乏，尚不能實現(xiàn)精準調(diào)控。

大麥是啤酒的主要原料，通過制麥和糖化將大分子物質(zhì)水解成酵母可以吸收利用的碳、氮源及其他營養(yǎng)組分，其含量和組成直接影響酵母的生理狀態(tài)、發(fā)酵過程的釀造性能，乃至最終產(chǎn)品風味的一致性。目前，隨著生產(chǎn)過程其他環(huán)節(jié)工藝控制水平的越來越高，全球原料采購帶來的質(zhì)量波動成為制約風味一致性控制的關鍵。現(xiàn)有的配方技術已經(jīng)實現(xiàn)了碳、氮水平及比例的合理控制，但酵母的發(fā)酵性能和啤酒風味仍存在波動，究其本質(zhì)是碳、氮源組分，尤其是參與啤酒風味代謝的麥汁氨基酸譜不一致導致。麥汁中含有除了半胱氨酸之外的19種基本氨基酸。在發(fā)酵過程中，氨基酸為酵母細胞的生長提供氮源，氨基酸的碳骨架參與酵母細胞中其他氨基酸、蛋白質(zhì)及酶的生物合成，以及啤酒風味物質(zhì)的形成[6-9]。

前期已經(jīng)通過人為配制不同氨基酸組成的合成培養(yǎng)基在相同條件下進行發(fā)酵實驗，研究了培養(yǎng)基中影響酵母發(fā)酵性能及醇酯風味形成的4種關鍵氨基酸：谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）和賴氨酸（Lys）[10]。作者在前期研究的基礎上，結合工業(yè)生產(chǎn)麥汁的現(xiàn)狀，通過關鍵氨基酸添加的發(fā)酵實驗，研究關鍵氨基酸對酵母生長、風味物質(zhì)代謝的影響。明確麥汁中影響Lager酵母發(fā)酵性能的關鍵氨基酸及其作用，為深入研究啤酒風味一致性提供技術保障，也為大麥品種及原料配方（種類和比例）的替換提供技術支持，同時為麥芽質(zhì)量控制、配方技術和育種提供新的研究方向和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌株Lager酵母菌株Saccharomyces pasorianusTT-1：青島啤酒廠。

主要試劑酵母培養(yǎng)基（YPD）、酵母無氨基氮源基礎（YNB）、20種氨基酸及 K2HPO4：北京索萊寶科技有限公司；麥芽三糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳酸：國藥集團化學試劑有限公司；17AA氨基酸水解標樣（2.5 mmol/L）、硼酸緩沖液、衍生劑粉末 2A、衍生劑稀釋液 2B：美國 Waters公司；色氨酸、三水乙酸鈉、三乙胺：瑞士Fluka公司；乙腈（UV級）：美國Burdick&Jackson公司；95%乙醇：南京試劑股份有限公司；雙乙酰、戊二酮、乙醛和醇酯標準樣：德國Sigma公司。

1.2 方法

EBC管發(fā)酵實驗

1）生產(chǎn)廠取回收酵母，轉移至50 mL滅菌離心管后4 000 r/min離心10 min，棄上清液及表面酵母層。

2）稱取 1.1 g 酵母（2×107個）裝入滅菌離心管中，分別取培養(yǎng)基混合均勻。

3）將離心管中酵母加入含有220 mL麥汁（或培養(yǎng)基）的Scott瓶中，混勻，加入1滴消泡劑。

4）Scott瓶充氧，左右搖晃20次，放氣，重復2次。

5）Scott瓶中培養(yǎng)基及酵母轉入EBC管，開始發(fā)酵（12℃）。

6）10 d后發(fā)酵結束進行相應理化指標的分析。

關鍵氨基酸添加的發(fā)酵實驗

1）合成培養(yǎng)基的關鍵氨基酸添加發(fā)酵實驗：根據(jù)工業(yè)生產(chǎn)13°P麥汁的糖譜及氨基酸譜，進行合成培養(yǎng)基的配制，見表1，并用20%乳酸調(diào)至pH 5.4。在合成培養(yǎng)基的基礎上增加或減少4種關鍵氨基酸，并在相同條件下進行EBC管發(fā)酵驗證實驗。

表1 合成培養(yǎng)基的配制Table 1 Formulation of synthetic medium

Glu調(diào)整：從64 mg/L增加到138 mg/L；Pro調(diào)整：從383 mg/L增加到417 mg/L；Lys調(diào)整：從93 mg/L降低到71 mg/L；Val調(diào)整：從125 mg/L降低到110 mg/L。

2）工業(yè)生產(chǎn)麥汁的關鍵氨基酸添加發(fā)酵實驗：在工業(yè)生廠麥汁的基礎上進行關鍵氨基酸的添加（30 mg/L Glu、50 mg/L Pro、25 mg/L Val和 20 mg/L Lys），并在相同條件下進行EBC管發(fā)酵驗證實驗。

酵母細胞數(shù)檢測發(fā)酵過程中懸浮酵母細胞數(shù)的測定采用Countstar?自動細胞計數(shù)儀進行。

麥汁氨基酸組分檢測采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）對氨基酸進行柱前衍生，通過梯度洗脫，紫外和熒光雙檢測器串聯(lián)檢測[11]。

啤酒風味物質(zhì)檢測使用氣相色譜儀Clarus 500 GC及頂空進樣器TurboMatrix 40對雙乙酰、乙醛、醇酯風味物質(zhì)（正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、己酸乙酯）進行檢測[12]。頂空進樣設置：爐溫60℃，加熱時間40 min，傳輸線溫度110℃，取樣針110℃，載氣25 psi。氣相色譜設置：起始溫度50℃，保持3 min；以30℃/min程序升溫至180℃，保持3 min；載氣為氮氣，流設為 15 psi，氫氣流量 45 mL/min，空氣流量 450 mL/min。檢測器設置：氫火焰離子化檢測器（FID）溫度250℃；進樣溫度150℃。

基于反相高效液相色譜，采用乙腈和0.01%三氟乙酸的水溶液作為流動相，梯度洗脫，在Atlantis C18色譜柱上，210 nm紫外檢測，定量檢測啤酒中芳香醇（酪醇、β-苯乙醇和色醇）的含量[13]。

數(shù)據(jù)分析每個發(fā)酵實驗結果均為3個生物學重復的平均值，采用IBM SPSS Statistics 22軟件中單因素ANOVA方法進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與討論

2.1 合成培養(yǎng)基中關鍵氨基酸添加/減少的發(fā)酵實驗

通過在合成培養(yǎng)基中增加谷氨酸和脯氨酸的質(zhì)量濃度，各氨基酸的終質(zhì)量濃度符合工廠麥汁的含量。并檢測谷氨酸和脯氨酸增加對酵母增殖及醇酯風味物質(zhì)生成的影響。

結果表明，提高谷氨酸和脯氨酸的質(zhì)量濃度均會抑制發(fā)酵過程中酵母的增殖，見圖1，顯著降低發(fā)酵過程的峰值酵母數(shù)；此外，二者的質(zhì)量濃度還會抑制發(fā)酵過程中芳香醇的生成，與脯氨酸相比，谷氨酸的抑制作用更加顯著（p＜0.05）；但增加這兩種氨基酸的質(zhì)量濃度對于醇酯的生成無顯著影響，見圖2。

通過在合成培養(yǎng)基中降低纈氨酸和賴氨酸的質(zhì)量濃度，并檢測纈氨酸和賴氨酸降低對酵母增殖及醇酯風味物質(zhì)生成的影響。

圖1 提高谷氨酸和脯氨酸質(zhì)量濃度對酵母增殖的影響Fig.1 Influence of glutamate acid and proline addition on yeast growth

圖2 提高谷氨酸和脯氨酸質(zhì)量濃度對醇酯風味物質(zhì)生成的影響Fig.2 Influence of glutamate acid and proline addition on flavor generation

結果表明，降低纈氨酸和賴氨酸的質(zhì)量濃度均會抑制發(fā)酵過程中酵母的增殖，見圖3。降低賴氨酸質(zhì)量濃度會顯著促進β-苯乙醇的生成并抑制酪醇的生成（p＜0.05），但對高級醇及酯類的生成無顯著影響。降低纈氨酸質(zhì)量濃度，會顯著抑制高級醇及芳香醇的生成（p＜0.05），對酯類生成無顯著影響，見圖4。

從關鍵氨基酸添加/減少的發(fā)酵實驗結果可以看出，谷氨酸/脯氨酸與纈氨酸/賴氨酸對發(fā)酵過程中酵母增殖的影響有所不同。推測谷氨酸/脯氨酸可能通過抑制酵母對麥汁氨基酸的吸收從而抑制酵母增殖，而纈氨酸/賴氨酸作為酵母的偏好性氮源營養(yǎng)物質(zhì)，促進了酵母的增殖[10，14]。圖4中關鍵氨基酸中除了纈氨酸對高級醇生成的正調(diào)控作用外，其余氨基酸質(zhì)量濃度的波動對高級醇及酯類風味物質(zhì)的生成均無顯著影響。纈氨酸對高級醇生成的促進作用與纈氨酸直接參與Ehrlich途徑并形成高級醇有關[15]。研究表明，苯丙氨酸和酪氨酸分別參與了β-苯乙醇和酪醇的代謝[16]，而關于谷氨酸、纈氨酸和賴氨酸對芳香醇生成的影響卻未見報道。分析原因可能與酵母對這3種關鍵氨基酸及苯丙氨酸/酪氨酸吸收的競爭抑制作用有關。

圖3 降低纈氨酸和賴氨酸質(zhì)量濃度對酵母增殖的影響Fig.3 Influence of valine and lysine reduction on yeast growth

圖4 降低纈氨酸和賴氨酸質(zhì)量濃度對醇酯風味物質(zhì)生成的影響Fig.4 Influence of valine and lysine reduction on flavor generation

2.2 工業(yè)生產(chǎn)麥汁的關鍵氨基酸添加發(fā)酵實驗

為研究關鍵氨基酸質(zhì)量濃度過高時，是否會對酵母的發(fā)酵性能及風味物質(zhì)的生成產(chǎn)生影響，取工業(yè)生產(chǎn)麥汁 （營養(yǎng)充足），分別添加4種關鍵氨基酸，進行EBC管發(fā)酵實驗。麥汁的氨基酸譜情況見表2。

表2 工業(yè)生產(chǎn)麥汁氨基酸譜Table 2 Amino acids profile of the brewery wort

通過在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中增加谷氨酸和脯氨酸的質(zhì)量濃度，并檢測谷氨酸和脯氨酸過量對酵母增殖及醇酯風味物質(zhì)生成的影響。

結果表明，添加谷氨酸和脯氨酸會顯著抑制酵母增殖（見圖5），導致峰值酵母數(shù)降低。但兩者對發(fā)酵后期懸浮酵母數(shù)的影響不同：谷氨酸會促進發(fā)酵后期酵母的沉降，而脯氨酸會抑制發(fā)酵后期酵母的沉降（p＜0.05）。除添加谷氨酸對β-苯乙醇的顯著抑制作用外（p＜0.05），這兩種氨基酸對醇酯類風味物質(zhì)的生成無顯著影響，見圖6。該結果與上述利用合成培養(yǎng)基進行的關鍵氨基酸調(diào)整的發(fā)酵實驗結果一致。

圖5 麥汁添加谷氨酸和脯氨酸對酵母增殖的影響Fig.5 Influence of glutamate acid and proline addition in wort on yeast growth

在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中增加賴氨酸和纈氨酸的質(zhì)量濃度，并檢測賴氨酸和纈氨酸過量對酵母增殖及醇酯風味物質(zhì)生成的影響。結果表明，在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中添加賴氨酸對酵母增殖有顯著促進作用，而纈氨酸的作用不明顯，見圖7。添加纈氨酸顯著促進異丁醇的生成；酪醇的生成受到賴氨酸的抑制（p＜0.05）；這兩種氨基酸對酯類風味物質(zhì)的生成無顯著影響，見圖8。

圖6 麥汁添加谷氨酸和脯氨酸對醇酯風味物質(zhì)生成的影響Fig.6 Influence of glutamate acid and proline addition in wort on flavor generation

關鍵氨基酸在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中質(zhì)量濃度的波動對酵母增殖及醇酯風味物質(zhì)生成的影響與上述利用合成培養(yǎng)基進行的關鍵氨基酸質(zhì)量濃度調(diào)整的發(fā)酵實驗結果基本一致。但在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中添加纈氨酸對酵母增殖無顯著影響，且其對芳香醇生成的抑制作用也不顯著，推測這可能與工業(yè)生產(chǎn)麥汁的營養(yǎng)成分的復雜性有關。

圖7 麥汁添加纈氨酸和賴氨酸對酵母增殖的影響Fig.7 Influence of valine and lysine addition in wort on yeast growth

圖8 麥汁添加纈氨酸和賴氨酸對醇酯風味物質(zhì)生成的影響Fig.8 Influence of valine and lysine addition in wort on flavor generation

3 結 語

麥汁營養(yǎng)組分（主要包括碳源和氮源）直接影響酵母的生理狀態(tài)、發(fā)酵性能及風味物質(zhì)代謝。現(xiàn)有的啤酒釀造技術已經(jīng)實現(xiàn)了碳源的合理控制，但酵母的發(fā)酵性能、啤酒風味特征的典型性和一致性仍難以達到精準控制，究其本質(zhì)是參與風味物質(zhì)代謝的氮源尤其是氨基酸質(zhì)量濃度與比例的差異性導致。

麥汁關鍵氨基酸對于工廠麥汁氮源組分的控制非常重要。通過關鍵氨基酸添加實驗確定了關鍵氨基酸對酵母生長、風味代謝的作用：其中谷氨酸和脯氨酸抑制酵母增殖；纈氨酸會促進高級醇的生成；賴氨酸會促進酵母的增殖。對麥汁中關鍵氨基酸在Lager酵母發(fā)酵過程中的作用機制的明晰，能夠為Lager啤酒釀造的氮源優(yōu)化提供理論依據(jù)和方法指導。