袁文博， 江 波， 張 濤

（食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

柚苷酶是由 α-L-鼠李糖苷酶 （α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）和 β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21）組成的酶復合體[1]。 它可作用于柚皮苷、槲皮苷、柴胡皂苷、蘆丁、橘皮苷等架構(gòu)末端有α-鼠李糖和β-葡萄糖的人工或天然的糖苷類化合物[2]。柚苷酶可以將蕓香科水果果汁中最主要的苦味物質(zhì)柚皮苷分兩步水解成鼠李糖、柚皮素和葡萄糖，以達到脫苦的目的[3]，這兩種酶在參與反應過程中是先后起作用的，具體反應如下：

與其他脫苦方法相比，酶法脫苦具有效果好、無污染、成本低、工藝簡單、專一性強、反應條件溫和、不破壞果汁中的風味和營養(yǎng)成份等優(yōu)點[3]，具有良好的應用前景。除此之外，柚苷酶在活性物質(zhì)改性[4]、增強物質(zhì)生物學活性[5]、葡萄酒的增香[3]、物質(zhì)的分離制備[6]、制藥工業(yè)[7]等方面的應用也日益廣泛。

柚苷酶的來源非常廣泛，植物、動物和微生物中均有發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在柚苷酶的來源以微生物為主。例如胡奎[8]從土壤中分離出了一株搖瓶產(chǎn)酶達291 U/mL，經(jīng)NTG誘變后可達1 282 U/mL。文蓉[9]在發(fā)霉的柚子皮上篩選到一株產(chǎn)柚苷酶的青霉菌，經(jīng)誘變后酶活達573.6 U/mL。據(jù)報道，國外已有少量的柚苷酶實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但價格昂貴，難以適應食品工業(yè)的需求。而在國內(nèi)并沒有實現(xiàn)柚苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)，主要是缺乏適合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株[10]；其次是缺少成熟的柚苷酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝。因此，發(fā)現(xiàn)新的柚苷酶微生物來源，并研究其發(fā)酵柚苷酶的條件具有重要的科學研究及應用價值。

從自然界篩選出來的野生菌株通常具有遺傳不穩(wěn)定、性能和耐受性差等缺點，常常不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此采用不同的方法對分離出來的野生菌株進行誘變選育是不可或缺的[11]。新型常壓室溫等離子體（ARTP）誘變系統(tǒng)，通過發(fā)射含有活性粒子的等離子體，能夠有效引起DNA的多樣性損傷，最終導致微生物突變。ARTP生物誘變育種技術(shù)與傳統(tǒng)微生物誘變方法相比，具有安全性高、操作簡易、成本低、快速有效等優(yōu)勢[12-14]，已經(jīng)成為微生物誘變育種領域的一個新的研究熱點。目前，尚未有使用常壓室溫等離子體誘變篩選柚苷酶高產(chǎn)菌株方法的報道。

作者以實驗室篩選出的一株之前并未報道過的產(chǎn)柚苷酶菌株A.alternate SK37.001為出發(fā)菌株，通過常溫室壓等離子體誘變，發(fā)酵酶活大幅度提高。之后研究了碳源、氮源等因素對菌株產(chǎn)柚苷酶的影響，通過單因素、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnken設計對菌株產(chǎn)柚苷酶的液態(tài)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，目的在于獲得菌株發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的最佳培養(yǎng)基，為進一步工業(yè)化生產(chǎn)柚苷酶提供了技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株互隔交鏈孢霉（A.alternate）：保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為CCTCC NO：M 2015309。

1.1.2 培養(yǎng)基斜面保藏培養(yǎng)基采用馬鈴薯培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200，蔗糖 20，瓊脂 20；pH 自然，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基與初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖5、柚皮苷 5，NaNO32，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.1；pH 自然，121 ℃滅菌 20 min。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1200；色譜柱：Sepax GP-C18 4.6 mm×250 mm；超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司SCIENTZ-ⅡD；ARTP微生物誘變育種機：北京思清源生物技術(shù)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柚苷酶粗酶液的制備將菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，以5%的接種體積分數(shù)接種在含40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在30℃、200 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵96 h，取發(fā)酵液在常溫下10 000 r/min離心20 min后收集菌體沉淀，用pH 4.0的磷酸氫二鈉（0.1 mol/L）-檸檬酸（0.05 mol/L）緩沖液洗滌菌體3次，用與發(fā)酵液等體積的緩沖液溶解，用6 cm的超聲波探頭超聲破碎10 min，功率為20%，得到懸浮液在10 000 r/min下離心10 min，取上清液即為胞內(nèi)粗酶液。

1.3.2 酶活測定方法

1）樣品的前處理：取2 mL用緩沖液制備的0.1%柚皮苷標準溶液于小離心管中，在40℃的恒溫振蕩水浴中預熱5 min。接著用移液槍加入0.1 mL的粗酶液，充分振蕩混勻，精確計時保溫10 min后從恒溫水浴中取出放入沸水浴中10 min，使酶失活，加入1.9 mL的甲醇溶液，經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清液。空白為加入滅活的粗酶液，其他操作相同。

2）柚皮苷和柚皮素的定性定量測定：將處理后的反應液用0.22 μm的濾膜過濾，用HPLC（采用Sepax C18色譜柱）檢測柚皮苷和柚皮素的峰面積。色譜條件：流動相組成為 V甲醇∶V水=1∶1，流速 1 mL/min，柱溫 35℃，檢測波長 280 nm，進樣量 10 μL。

3）柚苷酶酶活力的定義：在溫度40℃、pH 4.0條件下，每分鐘消耗1 μg柚皮苷為1 U。

1.3.3 互隔交鏈孢霉的常壓室溫等離子體誘變方法

1）單孢子懸浮液的制備：取活化好的A.alternate SK37.001斜面，用無菌生理鹽水沖洗，將其裝入含有無菌玻璃珠的搖瓶內(nèi)振蕩15 min，采用無菌雙層擦鏡紙過濾，即得單孢子懸液。然后用血球計數(shù)板對懸液中的孢子進行鏡檢計數(shù)，并將孢子濃度調(diào)整到 106～107個/mL。

2）ARTP誘變操作：將10 μL的孢子懸液均勻涂步于金屬載片的表面上。采用氦氣為工作氣體，設置處理功率為120 W，處理距離為2 mm，氣流量為10 SLM，在此條件下對A.alternate SK37.001進行誘變處理。為了尋找最佳的誘變處理時間，作者將孢子分別處理 0、20、30、40、50、60、80、100、120 s，對處理過的樣品在適當?shù)南♂尪认峦堪?，通過CFU來計算致死率，并繪出致死曲線[15]。

致死率（%）=（（U－T）/U）×100%

式中，U為不經(jīng)誘變處理生長的菌落數(shù)；T為經(jīng)誘變處理后生長的菌落數(shù)。

1.3.4 生物量的測定將搖瓶發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min，將沉淀用蒸餾水洗滌3次，置于105℃下烘干至恒重，冷卻后稱重。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗設計按照1.3.1的方法，通過酶活的比較，分別考察碳源的種類和最佳配比、氮源的種類對A.alternate發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的影響。在單因素實驗結(jié)果的基礎上采用Plackett-Burman試驗篩選重要因子，然后對重要因子進行最陡爬坡實驗確定重要因子的最佳添加量，最后根據(jù)Box-Behnken實驗原理，用design expert 8.0.6軟件在最陡爬坡試驗的基礎上進行實驗設計，通過實驗數(shù)據(jù)擬合得到響應面模型，最終確定最優(yōu)實驗條件，并進行驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 常溫室壓等離子體誘變對互隔交鏈孢產(chǎn)柚苷酶的影響

按方法1.3.3對A.alternata SK37.001誘變致死率進行計算，得到致死率曲線，見圖1。

圖1 ARTP誘變對互隔交鏈孢霉SK37.001的致死率曲線Fig.1 Lethality rate of Alternaria alternata 37.001 by ARTP

從圖1可以看出，等離子體對互隔交鏈孢霉SK37.001的致死率存在著顯著的劑量效應關(guān)系，誘變時間越長，菌株的致死率越高。ARTP對互隔交鏈孢霉具有很強的致死率，當誘變時間為80 s時，致死率就超過90%，而誘變時間達到150 s時，幾乎沒有存活。由于誘變產(chǎn)生的正突變具有隨機性，為了保證篩選到正突變菌株，同時也能夠快速分離生存能力高的菌株，故選取處理時間為80、100、120 s，三個不同致死率下的孢子懸液進行混合涂布。

通過涂布后生長菌株透明圈的大小進行初篩，然后復篩得到了一株產(chǎn)酶能力達327.32 U/mL的菌株，相比于野生菌株產(chǎn)酶能力提高了近208%，菌體干重增長了123.7%，把此誘變后的菌株命名為Alternaria alternata SK37.002，通過遺傳性狀穩(wěn)定性試驗，Alternaria alternata SK37.002在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)8代，菌株生長穩(wěn)定，其柚苷酶產(chǎn)量穩(wěn)定在316.14～331.23 U/mL之間，表明該菌株遺傳性能穩(wěn)定。

2.2 不同碳源對互隔交鏈孢產(chǎn)柚苷酶的影響

在預實驗中發(fā)現(xiàn)當蔗糖或葡萄糖質(zhì)量濃度大于5 g/L時，會抑制柚苷酶的產(chǎn)生。所以分別選取柚皮苷和鼠李糖為誘導物，選取最適誘導物的添加量，同時尋找最適的碳源，以下面4種情況探究最佳配比的碳源。

1）以柚皮苷為惟一碳源：分別配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷培養(yǎng)基；

2）以鼠李糖為惟一碳源：分別配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的鼠李糖培養(yǎng)基；

3）以5 g/L葡萄糖為基礎碳源：分別配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷作為誘導物的培養(yǎng)基；

4）以5 g/L的蔗糖為基礎碳源：分別配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷作為誘導物的培養(yǎng)基。

在相同培養(yǎng)條件下進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每種碳源做3次平行實驗，4 d后用HPLC法測酶活，取平均值，以柚皮苷或鼠李糖添加量為橫坐標，柚苷酶酶活為縱坐標，得到不同碳源對Alternaria alternata SK37.002產(chǎn)柚苷酶的影響見圖2。

圖2 不同碳源對互隔交鏈孢酶SK37.002產(chǎn)柚苷酶的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on naringinase productivity of Alternaria alternata SK37.002

微生物與糖利用有關(guān)的許多酶都是誘導性的，柚苷酶也是誘導酶。由圖2可以看出，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中是否添加誘導物顯著影響其產(chǎn)酶，說明A.alternata SK37.002產(chǎn)柚苷酶需要誘導物誘導，這與胡奎[8]的研究結(jié)果相同。底物柚皮苷和產(chǎn)物鼠李糖均有誘導作用，其中柚皮苷誘導作用更好，而且添加量為1.5 g/L時菌株產(chǎn)酶能力即達到頂點，再繼續(xù)添加柚皮苷酶活增加不明顯。在以柚皮苷為誘導物時，用蔗糖作為碳源比葡萄糖更適宜，究其原因可能是因為葡萄糖作為碳源時，會形成葡萄糖效應[16]。同時含有一定量的蔗糖可以加快孢子萌發(fā)、加速菌絲生長[17]，非常有助于胞內(nèi)酶酶活的提高。最終選取5 g/L的蔗糖作為碳源，1 g/L的柚皮苷作為誘導物。

2.3 不同氮源對互隔交鏈孢SK37.002產(chǎn)柚苷酶的影響

在最適碳源和誘導物的基礎上，分別配制添加量為 4 g/L 的蛋白胨、酵母提取物、（NH4）2SO4、牛肉膏、NaNO3、玉米漿這6種不同氮源的培養(yǎng)液，以1.3.1的方法進行培養(yǎng)，每種氮源做3次平行實驗，用HPLC法測酶活，并取平均值，結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對A.alternata SK37.002產(chǎn)柚苷酶的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on naringinase productivity of A.alternata SK37.002

從圖3可以看出，氮源對互隔交鏈孢霉產(chǎn)柚苷酶的影響較大，當以硫酸銨、酵母提取物、蛋白胨作為氮源時，酶活偏低；而硝酸鈉作為氮源時，柚苷酶酶活最高，為467.96 U/mL，其次是牛肉膏、玉米漿。這可能是由于A.alternata能夠更好地利用NO-中的氮離子，所以最后選擇硝酸鈉為A.alternata SK37.002菌株產(chǎn)柚苷酶的最佳氮源。

2.4 Plackett-Burman試驗設計

在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分的基礎上，選取柚皮苷質(zhì)量濃度、硝酸鈉質(zhì)量濃度、溫度、時間、氯化鈣質(zhì)量濃度、接種體積分數(shù)、硫酸鎂、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度這8個可能影響互隔交鏈孢霉SK37.002發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的因素進行全面考察，選用n=12的Plackett-Burman設計。每個因素取高（+1）低（-1）兩個水平，其中低水平為未優(yōu)化的原始培養(yǎng)基，高水平為低水平的1.25倍左右。PB試驗方案及試驗測定柚苷酶酶活的結(jié)果見表 1。 A、B、D、E、G、H、J、K 分別代表柚皮苷質(zhì)量濃度、硝酸鈉質(zhì)量濃度、溫度、時間、氯化鈣質(zhì)量濃度、接種體積分數(shù)、硫酸鎂質(zhì)量濃度和磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度，C、F、I為虛擬項，用于估計誤差，排除干擾。

用Design-Expert 8.0.6軟件對表1的數(shù)據(jù)進行柚苷酶活影響因子的顯著性分析，結(jié)果見表2。

表1 PB試驗設計方案及結(jié)果Table 1 Design and results of the Plackett-Burman experiment

表2 柚苷酶活影響因子的顯著性分析Table 2 Significant factor analysis of naringinase activity

由表2可以看出，對A.alternata SK37.002產(chǎn)柚苷酶影響較大因素主要有硝酸鈉（p=0.003 7）、氯化鈣（p=0.049）、磷酸氫二鉀（p=0.031），這 3 個因素對產(chǎn)酶影響較為顯著，其中硝酸鈉的p值小于0.01，可信度高于99%，氯化鈣和磷酸氫二鉀p值小于0.05，大于0.01，可信度高于95%。其中硝酸鈉的回歸系數(shù)為正數(shù)，為正效應，在設計響應面試驗時要適當增加其添加量，氯化鈣和磷酸氫二鉀為負效應，設計試驗時應適當減少其添加量。因此，選擇這三個因素做響應面實驗。

2.5 最陡爬坡實驗

由于響應面擬合方程只有在考察的附近區(qū)域里才充分接近實際的情形，因此應使得顯著因素的水平盡量接近最大產(chǎn)酶區(qū)域再創(chuàng)建有效的擬合方程，最陡爬坡實驗能夠滿足此要求。根據(jù)PB試驗得到的結(jié)論，設定爬坡方向和步長，硝酸鈉每次提高0.5個單位，氯化鈣和磷酸氫二鉀每次降低0.1個單位，結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiment

由表3可知，0+△2水平時柚苷酶酶活達到最大值，可以確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基在0+△2水平附近，故選此水平為中心點進行接下來的響應面設計。

2.6 Box-Behnken Design試驗設計及結(jié)果

Box-Behnken Design（BBD）法是響應面分析法中常用的設計方法之一，可以用較少的實驗次數(shù)對實驗進行全面研究，通過對幾個響應過程變量進行數(shù)學建模和分析來定向優(yōu)化分析的因素[18]。作者依據(jù)Plackett-Burman試驗確定的因素與最陡爬坡實驗確定的范圍，采用BBD實驗設計A.alternate SK37.002發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶培養(yǎng)基進行三因素三水平的響應面分析，各個因素與水平見表4，BBD實驗設計及結(jié)果見表5。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行二次回歸分析，得到回歸方程為：Y=612.98+21.68X1-9.23X2+2.24X3-6.06X1X2+1.31X1X3-3.04X2X3-21.02X12-24.14X22-27.71X32，對二階回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表6。

表4 BBD試驗影響因子和水平設計Table 4 Factors and levels of the BBD experiment

表5 BBD試驗設計及結(jié)果Table 5 Design and results of the BBD experiment

表6 二次回歸方程的方差分析Table 6 Analysis of variance for the second order equation

從表6可以看出，模型回歸極顯著，其中方程的相關(guān)系數(shù)R2=98.67%，說明回歸方程的擬合程度很好。調(diào)整相關(guān)系數(shù)Adj R2=97.05%，說明響應面97.05%的變化可以由此模型解釋，模型與實際情況擬合得很好。硝酸鈉和氯化鈣對A.alternate SK.37.002菌株產(chǎn)柚苷酶的影響非常顯著，并且二者之間有較為顯著的交互作用。同硝酸鈉和氯化鈣之間的交互作用相比，硝酸鈉與磷酸氫二鉀、氯化鈣與磷酸氫二鉀之間的交互作用并不顯著。這表明了各因素對柚苷酶酶活的影響并不是單純的線性關(guān)系，二次項對柚苷酶活也有重要的影響。表格中失擬項P=0.63，大于0.05，表明試驗數(shù)據(jù)正常，模型合適。

為了確定最佳液態(tài)發(fā)酵條件，用Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型進行響應面分析。繪制三維立體響應面圖，其中每個響應面分析圖分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在最佳水平，見圖4。

圖4 各因素交互作用的響應面圖Fig.4 Response surface plots for the pairwise interactive effects of NaNO3，CaCl2 and K2HPO4 on naringinase activity in final fermentation broth

從圖4可以看出，硝酸鈉、氯化鈣、磷酸氫二鉀添加量與酶活存在顯著的相關(guān)性，回歸方程存在最大值，為了求得 X1、X2、X3的最佳取值，對所得的回歸擬合方程的變量求一階偏導數(shù)，并令其為0，得到三元一次方程組，求解得出該模型的極值點：X1=3.40、X2=-19.72、X3=1.20，即硝酸鈉、氯化鈣、磷酸氫二鉀的最佳質(zhì)量濃度分別為5.11、0.69、0.83 g/L時，響應值Y達到最大值，即酶活最高為620.31 U/mL，菌體干重比未優(yōu)化前增長了142.3%，表7為近5年柚苷酶發(fā)酵酶活的對比。

表7 近5年柚苷酶發(fā)酵酶活對比Table 7 Comparison of Naringinase activity in five years

為了檢驗模型的準確性，在預測最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基下進行發(fā)酵實驗3次，為了方便操作，實驗選擇硝酸鈉、氯化鈣、磷酸氫二鉀的質(zhì)量濃度分別為 5，0.7，0.8 g/L，所得的實際酶活為（624.73±30.33）U/mL，與理論預測值620.31 U/mL接近，與初始酶活相比提高了90%。由此可見，響應面優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基成分準確可靠，具有實際意義。

3 結(jié)語

作者以實驗室篩選得到的Alternaria alternate為出發(fā)菌株。通過常溫室壓等離子體（ARTP）誘變獲得了一株發(fā)酵酶活達327.32 U/mL的菌株，產(chǎn)酶能力比野生菌株提高了208%?？梢钥闯鯝RTP誘變育種技術(shù)是一種新型、有效的微生物誘變育種方法，為柚苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了獲得優(yōu)良菌種的方法。通過單因素實驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡實驗和Box-Benhnken試驗對該菌產(chǎn)柚苷酶的液態(tài)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，得到Alternaria alternate產(chǎn)柚苷酶的最佳條件：蔗糖5 g/L、柚皮苷1 g/L、硝酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀0.8 g/L，氯化鈣0.7 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L。在此條件下，發(fā)酵酶活可達624.73±30.33 U/mL，比未優(yōu)化之 前增加了90.86%。