黎志德，梁達(dá)奉，黃曾慰，張九花，常國(guó)煒，劉桂云

（廣東省科學(xué)院廣東省生物工程研究所，廣東省酶制劑與生物催化工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510316）

α-葡聚糖酶（Dextranase，EC 3.2.1.11）可以專(zhuān)一性水解α-1,6-糖苷鍵，使大分子的葡聚糖水解成小分子的寡聚糖[1]。甘蔗在收割、存放和后續(xù)加工生產(chǎn)環(huán)節(jié)中容易發(fā)生細(xì)菌感染導(dǎo)致α-葡聚糖的產(chǎn)生。文獻(xiàn)指出[2]，蔗汁中出現(xiàn)的 α-葡聚糖其高聚合度部分的占比高達(dá)31.32%，相對(duì)分子質(zhì)量可以達(dá)到1.02×106，這對(duì)于精煉糖的生產(chǎn)和成品質(zhì)量都有不良影響。煉糖生產(chǎn)時(shí)，α-葡聚糖在溶糖和澄清工段的累積會(huì)增大糖漿粘度，減慢過(guò)濾速度、絮凝速度及浮渣壓緊速度，阻塞脫色系統(tǒng)，而在結(jié)晶工段則引起糖蜜粘度增高，蔗糖分結(jié)晶率降低，結(jié)晶異形體出現(xiàn)等現(xiàn)象。因此α-葡聚糖酶在甘蔗亞硫酸法制糖[3,4]、原糖精煉[5]以及甜菜制糖[6]都有應(yīng)用。文獻(xiàn)指出，加入0.05 U/mL的酶即可將蔗汁中濃度為800～900 mg/kg °Bx的α-葡聚糖完全去除[7]。另有報(bào)道[8]在甘蔗混合汁中加入國(guó)外已有商業(yè)化應(yīng)用的α-葡聚糖酶，按酶活30000 U/mL計(jì)算加入5～10 mg/kg，反應(yīng)30 min后，葡聚糖去除率接近90%。同時(shí)，甘蔗制糖生產(chǎn)線上實(shí)驗(yàn)表明，降解的α-葡聚糖可以減少沉降時(shí)間，提高簡(jiǎn)純度[9]。由于 α-葡聚糖酶在pH接近中性以及高溫下酶促反應(yīng)活性均會(huì)受到影響[10,11]，因此甘蔗制糖生產(chǎn)線應(yīng)用時(shí)在選擇反應(yīng)環(huán)境條件相對(duì)溫和而且停留時(shí)間較長(zhǎng)的點(diǎn)加入，例如壓榨車(chē)間第 1座及倒數(shù)第 2座壓榨機(jī)組的蔗汁槽[12]，或者將蔗汁槽條件溫度控制在20到45 ℃之間，pH在5.4到6.8之間[13]；但是，在煉糖生產(chǎn)中，溶糖的糖漿濃度一般大于 50 °Bx，溶液粘度很大，同時(shí)pH在6.0到6.8之間，溫度大于65 ℃，根據(jù)此前在無(wú)機(jī)緩沖鹽溶液中的數(shù)據(jù)，此條件會(huì)造成α-葡聚糖酶酶促反應(yīng)速率和穩(wěn)定性明顯下降。另一方面，文獻(xiàn)也提出高濃度蔗糖對(duì)酶蛋白有一定的保護(hù)作用[14]。同時(shí)，由于原糖原有的葡聚糖并不會(huì)隨著煉糖生產(chǎn)流程被大幅除去，反而會(huì)在結(jié)晶時(shí)混入精糖當(dāng)中，因此同一批次原料會(huì)持續(xù)影響成品品質(zhì)，使其對(duì)后續(xù)深加工造成影響更為突出。文獻(xiàn)指出[5]，通過(guò)改變工藝參數(shù)，α-葡聚糖酶同樣可以快速清除原糖糖漿、過(guò)濾清漿和脫色清漿中的α-葡聚糖，并在連續(xù)加入24 h后，精糖成品不再檢出葡聚糖。此前文獻(xiàn)多以酶在最適條件下的反應(yīng)特征為基準(zhǔn)，去考慮如何在制糖生產(chǎn)中的應(yīng)用，較少研究酶在具體生產(chǎn)工藝條件下的情況，因此本文針對(duì)性地模擬煉糖條件，研究α-葡聚糖酶在類(lèi)似條件下的活性變化。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

α-葡聚糖酶凍干粉，葡聚糖單克隆抗體檢測(cè)試劑盒，（原糖），廣東省生物工程研究所；α-葡聚糖T-2000標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)法瑪西亞公司；3,5-二硝基水楊酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖、檸檬酸，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，無(wú)水亞硫酸鈉，苯酚（分析純），廣州化學(xué)試劑廠。

α-葡聚糖酶基因序列來(lái)源于Chaetomium，由重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)，廣州市微生物所制作成凍干粉，酶在pH 5.5下保存，最適反應(yīng)溫度為50～60 ℃，最適反應(yīng) pH為5～6。分析純蔗糖應(yīng)預(yù)先測(cè)定原始葡聚糖含量。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

FiveEasy? FE20 pH計(jì)，AL104電子分析天平，美國(guó)梅特勒公司；DK-S24型電熱恒溫水浴箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；2800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)尤尼科公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備

取 α-葡聚糖酶凍干粉用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解，pH 5.5，粉末與緩沖液的質(zhì)量體積比不低于1：20，定容，測(cè)定酶活，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ富顪y(cè)定方法按DNS（3,5-二硝基水楊酸）法[15]，即將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，加入到底物溶液中，55 ℃水浴反應(yīng)10 min，加入DNS，沸水浴5 min，定容，測(cè)定OD540nm。

酶活定義：采用 DNS法，每分鐘催化底物（α-葡聚糖T-2000標(biāo)準(zhǔn)品）水解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，以U表示。

剩余酶活定義：在經(jīng)過(guò)改變?nèi)芤涵h(huán)境，溫度和pH條件處理后，按一定時(shí)間重新測(cè)定酶活，以起始酶活為100%，處理后測(cè)定數(shù)據(jù)折算成對(duì)應(yīng)百分比。

1.2.2 高溫條件下α-葡聚糖酶的酶活變化

將酶液分別在55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃下水浴保溫，于5 min、10 min、15 min分別取樣，測(cè)定酶活。

1.2.3 高溫與近中性pH條件下α-葡聚糖酶的酶活變化

將酶液分別使用pH 5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液按照體積比1：9稀釋?zhuān)?5 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃下水浴保溫，于5 min、10 min、15 min后取樣，測(cè)定酶活。

1.2.4 蔗糖濃度對(duì)測(cè)定酶活的影響

按照質(zhì)量體積比2%將標(biāo)準(zhǔn)α-葡聚糖T-2000標(biāo)準(zhǔn)品加入到預(yù)先配制好的10、20、30、40、50、60 °Bx蔗糖溶液，加熱攪拌至完全溶解，冷卻后置于4 ℃保存?zhèn)溆茫尤氩襟E1.2.1中預(yù)處理的酶液，測(cè)定酶活。

1.2.5 在60 °Bx蔗糖溶液，高溫、中性pH環(huán)境下α-葡聚糖酶的酶活變化

配制60 °Bx的蔗糖溶液，其初始pH一般在pH 6.0左右，分別用1 mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.5、6.0、7.0、8.0，置于4 ℃保存?zhèn)溆?。反?yīng)前，與酶液按照體積比1：9的比例混合均勻，并在55、65、75、85 ℃下水浴保溫，于5 min、10 min、15 min后取樣，測(cè)定酶活。

1.2.6 酶濃度對(duì)酶熱穩(wěn)定性測(cè)定的影響

將酶液分別用60 °Bx蔗糖溶液稀釋10倍、100倍和1000倍，并在55 ℃下水浴保溫，于5 min、10 min、15 min后取樣，測(cè)定酶活。

1.2.7 酶在高溫環(huán)境下降解原糖中的α-葡聚糖

用蒸餾水將原糖溶解至60 °Bx，測(cè)定pH，分別在55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃下保溫，加入α-葡聚糖酶至濃度為0.3 U/mL，每隔10 min取樣測(cè)定葡聚糖含量，至1 h，α-葡聚糖含量按免疫比濁法測(cè)定[16]。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

預(yù)先按照DNS法得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：

葡萄糖含量（mg/mL）=A×OD540nm+b。

測(cè)定所得OD540nm值，按一下公式進(jìn)行換算：

酶活（U/mL）=（OD540nm-b）/A×稀釋倍數(shù)×1000/180

每次反應(yīng)前，先將預(yù)處理好的酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，以起始樣本測(cè)定所得酶活為 100%，然后按百分比折算各個(gè)反應(yīng)后樣本的值為剩余酶活，其中步驟 1.2.4中直接以無(wú)機(jī)鹽緩沖液中所測(cè)得酶活為100%。

步驟1.2.7計(jì)算葡聚糖含量方法見(jiàn)引用文獻(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度和pH變化對(duì)α-葡聚糖酶的影響

2.1.1 高溫下α-葡聚糖酶的酶活變化

取pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制的α-葡聚糖酶酶液在各溫度區(qū)間水浴，分時(shí)間段取樣并按照適當(dāng)?shù)谋壤♂專(zhuān)瑴y(cè)定酶活，折算成相對(duì)值：

圖1 高溫下的酶活變化Fig.1 The changes of enzyme activity under high temperature

從圖1中可見(jiàn)，在55 ℃下，α-葡聚糖酶活性在水浴后5 min出現(xiàn)明顯下降后保持相對(duì)穩(wěn)定，水浴15 min后剩余酶活為37.54%。在65 ℃，75 ℃和85 ℃下，水浴5 min后酶活進(jìn)一步下降，其中85 ℃的樣本酶活未檢出。說(shuō)明在磷酸鹽緩沖液中，當(dāng)溫度大于65 ℃時(shí)α-葡聚糖酶并不穩(wěn)定。

2.1.2 高溫與近中性pH條件下α-葡聚糖酶的酶活變化

圖2 在55 ℃和近中性pH條件下的酶活變化Fig.2 The changes of enzyme activity under 55 ℃ and near neutral pH

55 ℃水浴條件下，不同pH樣本酶活經(jīng)過(guò)折算后得到圖2。從圖中可見(jiàn)，在水浴保溫過(guò)程中，前5 min各組的酶活力都大幅下降，之后下降速率降低。在55 ℃，pH 6.0條件下的α-葡聚糖酶表現(xiàn)得更穩(wěn)定，保溫15 min后剩余酶活為64.53%。pH 5.5、pH 6.5、pH 7.0和pH 8.0的結(jié)果相類(lèi)似，5 min后，剩余酶活分別為52.52%、52.70%、55.00%和54.16%。15 min后分別為37.54%、36.62%、36.23%和23.26%，說(shuō)明在55 ℃下，弱酸性的pH環(huán)境對(duì)該酶保持穩(wěn)定性更有利[14]。

圖3 在65 ℃、75 ℃和中性pH下的酶活變化Fig.3 The changes of enzyme activity under 65 ℃,75 ℃ and neutral pH

在65 ℃到75 ℃區(qū)間內(nèi)，酶活損失明顯加快，5 min后所有樣本的酶活都剩余不足10%，隨著溫度的上升，接近中性pH環(huán)境的能保留更多酶活。而水浴溫度為85 ℃的各個(gè)樣本，酶活均未檢出。

2.2 蔗糖溶液對(duì)α-葡聚糖酶的影響

2.2.1 蔗糖濃度對(duì)酶活測(cè)定的影響

以緩沖液體系中測(cè)得酶活為 100%，將不同蔗糖濃度下測(cè)得的酶活折算成相對(duì)酶活，結(jié)果如圖所示。結(jié)果表明蔗糖濃度與 α-葡聚糖酶酶活測(cè)定值呈負(fù)相關(guān)，這是由于環(huán)境體系中粘度上升造成。實(shí)際生產(chǎn)中，由于糖漿粘度會(huì)隨著溫度上升而下降，同時(shí)高濃度的蔗糖對(duì)酶蛋白也有一定的保護(hù)作用，最終酶在生產(chǎn)線上的使用效果受以上三個(gè)因素共同影響。

圖4 蔗糖濃度對(duì)測(cè)定酶活的影響Fig.4 Effect of sucrose concentration on enzyme activity measure

2.2.2 在60 °Bx蔗糖濃度，高溫、近中性pH環(huán)境下α-葡聚糖酶的酶活變化

按時(shí)間段從不停pH的蔗糖溶液中取樣后經(jīng)稀釋后測(cè)定酶活，折算后統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：

表1 酶在高蔗糖濃度，近中性pH，高溫下的酶活變化Table 1 The effects of Near-neutral pH, high temperature and high sucrose concentration environment onenzyme activity

表中數(shù)據(jù)表明，α-葡聚糖酶在60 °Bx蔗糖溶液中活性能夠保持穩(wěn)定的溫度和pH的范圍都明顯增大。在55 ℃～75 ℃和pH 5.5～8.0的條件下，除了75 ℃，pH 8.0的這組樣本酶活損失明顯以外，其他樣本5 min后的剩余酶活都在80%以上。保溫10 min后，測(cè)得剩余酶活保持60%以上，15 min后保持在40%以上。

當(dāng)溫度達(dá)到 85 ℃時(shí)，酶的熱穩(wěn)定性出現(xiàn)明顯的下降，5 min后酶活都低于6%。隨著溫度的上升，中性pH樣本中酶的穩(wěn)定性較弱酸、弱堿性的樣本強(qiáng)，與此前緩沖液體系中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。綜上所述，在煉糖生產(chǎn)中使用α-葡聚糖酶時(shí)，將反應(yīng)環(huán)境保持在不高于75 ℃，預(yù)留15 min的停留時(shí)間，會(huì)明顯提升酶的反應(yīng)效率，減低使用量，提升效益。同時(shí)在甘蔗制糖生產(chǎn)中，為了避免蔗糖受熱水解形成還原糖，一般會(huì)將pH調(diào)節(jié)至中性附近，該操作有利于α-葡聚糖酶保持活性。

2.2.3 酶濃度對(duì)酶熱穩(wěn)定性測(cè)定的影響

圖5 酶液濃度對(duì)熱穩(wěn)定性測(cè)定的影響Fig.5 The effect of enzyme concentration on the determination of thermal stability

將不同稀釋倍數(shù)測(cè)得結(jié)果折算成相對(duì)酶活，結(jié)果如圖5。由圖5可見(jiàn)，α-葡聚糖酶在蔗糖溶液中稀釋倍數(shù)的變化，對(duì)酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果影響較小，不同組間差異不超過(guò)10%。

2.2.4 在65和75 ℃下加酶降解原糖中原有的葡聚糖

圖6 酶在不同溫度下降解原糖中的α-葡聚糖Fig.6 Enzymatic degradation of α-glucan in raw sugar at different temperature

取巴西進(jìn)口原糖，按質(zhì)量比3：3加入蒸餾水煮沸溶解，測(cè)得其最終錘度為64.5 °Bx，pH 5.92，四次取樣分別測(cè)得其葡聚糖含量 428、431、433和 428 mg/kg °Bx，加入濃度為0.3 U/mL的α-葡聚糖酶反應(yīng)1 h后結(jié)果如圖6。

由圖6可以得知，α-葡聚糖的降解大部分發(fā)生在酶加入后的前30 min，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，除55 ℃樣本α-葡聚糖含量還有比較明顯的下降外，其他溫度梯度下的樣本變化幅度并不大。因此在生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)，可以用 30 min作為酶的單次投放最大持續(xù)反應(yīng)時(shí)間。其中，65 ℃的樣本降解效果最好，在酶加入后30 min，剩余的α-葡聚糖已不足100 mg/kg。55 ℃和75 ℃的樣本效果次之，在反應(yīng)30 min后剩余不足200 mg/kg。繼續(xù)反應(yīng)至60 min，55 ℃的樣本中α-葡聚糖的含量會(huì)進(jìn)一步下降到100 mg/kg，與65 ℃樣本的結(jié)果較為接近。85 ℃下，α-葡聚糖酶在前10 min后失去大部分的活性，反應(yīng)60 min后 α-葡聚糖下降量不足100 mg/kg，說(shuō)明在85 ℃下，降解相同水平的α-葡聚糖時(shí)，需要提高酶的加入量。

3 結(jié)論

3.1 α-葡聚糖酶在高溫和近中性pH條件下能保持一定的穩(wěn)定性。無(wú)機(jī)鹽緩沖液條件下，在pH 5.5～7.0的環(huán)境，55 ℃水浴15 min后剩余酶活仍保持20%到40%的區(qū)間內(nèi)。在60 °Bx蔗糖溶液中，較高的溶液粘度使α-葡聚糖酶的酶促反應(yīng)速率下降，同時(shí)熱穩(wěn)定性得到明顯提升。在65 ℃，pH 5.5～8.0或75 ℃，pH 5.5～7.0下，水浴15 min后剩余酶活均可保持40%以上。

3.2 原糖精煉有多種工藝方案[17]，一般工藝流程是原糖經(jīng)過(guò)復(fù)篩后重溶，糖漿濃度保持在60 °Bx，溫度為80～85 ℃，而pH會(huì)因?yàn)樵桥尾煌兴町?，在pH 6.0左右波動(dòng)。因此，實(shí)驗(yàn)將蔗糖溶液濃度設(shè)定為60°Bx，模擬煉糖生產(chǎn)的工藝條件。同時(shí)，由于不同批次來(lái)源的蔗糖溶解后的溶液pH存在差異，實(shí)驗(yàn)中使用的蔗糖配成60 °Bx溶液后，pH一般在5.5～6.0之間。結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，考慮到pH 5.5是α-葡聚糖酶磷酸鹽緩沖體系中最適反應(yīng)溫度下的最適反應(yīng)pH，所以把試驗(yàn)pH范圍起點(diǎn)統(tǒng)一調(diào)整到pH 5.5。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，α-葡聚糖酶具有直接加入到生產(chǎn)線上的條件。生產(chǎn)使用時(shí)根據(jù)實(shí)際情況，可以通過(guò)將溶糖溫度控制在75 ℃以下，控制糖漿pH在中性附近和延長(zhǎng)酶的停留時(shí)間來(lái)提高酶去除葡聚糖的效率，當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)75%或者 pH偏向堿性時(shí)，需要加大酶的加入量保證效果。