程永霞，魏新雨，藍(lán)海波，王凱，趙雷，胡卓炎

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

龍眼(Dimocarpus longan Lour．)在中國有著悠久的種植和食用歷史，原產(chǎn)于中國南方[1]，在廣東、福建、廣西、海南等省份及臺(tái)灣地區(qū)均有著廣泛種植[2]。龍眼憑借其美好的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)價(jià)值，自古以來就被視為藥食兩用的滋補(bǔ)佳品[3]。龍眼果肉含糖量高，主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖，其中蔗糖含量最高，占總糖的60%～70%。同時(shí)龍眼果肉富含多糖[4,5]、多酚[6]、γ-氨基丁酸[7]及人體需要的礦物質(zhì)和微量元素[8,9]，現(xiàn)代藥理研究表明龍眼果肉的這些營養(yǎng)成分具有抗氧化[10]、抗癌[11]、增強(qiáng)免疫力[12]和保護(hù)關(guān)節(jié)[13]的功效。傳統(tǒng)龍眼加工產(chǎn)品主要有龍眼干（桂圓肉）、龍眼濃縮汁（龍眼膏）等產(chǎn)品。龍眼膏一般采用龍眼果汁加熱濃縮加工而成。龍眼果汁濃縮后蔗糖含量進(jìn)一步提高。隨著人們飲食觀念的改變，高糖食品因易引發(fā)肥胖，II型糖尿病和心血管疾病[14]，而不能滿足現(xiàn)代消費(fèi)者追求低糖（低熱量）的健康飲食需求。利用果糖基轉(zhuǎn)移酶將蔗糖轉(zhuǎn)換成為低聚果糖已有不少報(bào)道。低聚果糖是一種優(yōu)質(zhì)的益生元，其性質(zhì)穩(wěn)定，不被胃腸道內(nèi)源酶消化[15]，具備調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[16]、預(yù)防結(jié)腸癌[15]、改善脂質(zhì)代謝[17]、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收[18]、增強(qiáng)免疫力[19]等生理功能。低聚果糖（FOS）可以由蔗糖經(jīng)果糖基轉(zhuǎn)移酶處理后制得，是由1～3個(gè)果糖基通過β-(2-1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）的混合物[20]。目前已有研究探討用低聚果糖代替蔗糖制備功能性飲料的報(bào)道[21～23]，也有通過發(fā)酵或發(fā)酵產(chǎn)酶的方法除去果汁中的蔗糖制備低熱量原果汁的研究[14,24,25]。在果汁加工中采用酶處理一般是以提高出汁率或制備澄清果汁為目的，但利用酶法轉(zhuǎn)化果汁中蔗糖同時(shí)生成低聚果糖的研究尚鮮見報(bào)道?；邶堁酃崽呛扛叩奶攸c(diǎn)，利用果糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，探討不同酶處理時(shí)間、酶用量、溫度、底物濃度和pH等工藝參數(shù)對蔗糖的轉(zhuǎn)化和低聚果糖含量變化的影響，旨在為開發(fā)低熱量和富含低聚果糖的龍眼果汁的研究及實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼(Dimocarpus longan Lour．)為“儲(chǔ)良”品種，產(chǎn)于廣東茂名高州，于2016年8月成熟采摘；果糖基轉(zhuǎn)移酶（1824 U/mL），諾維信公司；檸檬酸（化學(xué)純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸鈉（化學(xué)純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；糖標(biāo)準(zhǔn)物：果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、果五糖（GF4），Sigma試劑公司；乙腈（色譜純），默克試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WZ103糖度計(jì)，上海天呈科技有限公司；FE320 pH計(jì)，上海梅特勒—托利多有限公司；JYL-C16D九陽打漿機(jī)，九陽股份有限公司；TD5-Ⅱ低速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；AUW120電子分析天平，日本島津公司；SHA-CA晶波水浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；5430-eppendorf高速離心機(jī)，德國eppendorf公司；移液器，德國eppendorf公司；海爾BCD-256KF型冰箱，青島海爾股份有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀（配示差檢測器RID），日本島津公司；NH2P-50 4E色譜柱，日本昭和電工公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的測定

參照Vega-Paulino等人[26]的方法，用0.1 mol/L pH 5.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將10 g蔗糖溶解并定容至100 mL，取20 mL蔗糖溶液，加入適量的酶，置于三角瓶中，于55 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫回旋式搖床中反應(yīng)60 min，取出于95 ℃，30 s滅酶處理，冷卻至室溫，于10000 r/min臺(tái)式離心機(jī)離心20 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜儀法（HPLC）分析GF2含量，并計(jì)算酶活。酶活力單位定義：在上述酶反應(yīng)條件下，將蔗糖轉(zhuǎn)化成低聚果糖，每分鐘產(chǎn)生1 μmol蔗果三糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位（U）[27]。

1.3.2 制備低聚果糖龍眼果汁工藝流程

龍眼→去皮、去核→打漿榨汁→過濾→濃縮→酶轉(zhuǎn)化處理→加熱鈍化酶活性→冷卻→樣品

選擇無病蟲害和機(jī)械損傷的龍眼，人工去皮去核后榨汁，過濾（過100目濾布），得龍眼原果汁，測定原汁總可溶性固形物含量（TSS）為20oBrix，pH 6.8；根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，加蒸餾水將原汁稀釋至TSS 10oBrix，或在60 ℃下真空濃縮至TSS 30、40、50和60oBrix，用檸檬酸調(diào)pH，隨后加入果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化，酶轉(zhuǎn)化結(jié)束后立即進(jìn)行95 ℃，30 s殺菌鈍化酶活性處理，冷卻，包裝，冷藏待分析。

1.3.3 酶轉(zhuǎn)化工藝參數(shù)的影響試驗(yàn)

分別以底物濃度（TSS）、pH、酶添加量（U/g蔗糖）、溫度和轉(zhuǎn)化作用時(shí)間對龍眼果汁中蔗糖含量、蔗糖轉(zhuǎn)化率、低聚果糖生成量和低聚果糖占果汁中總糖的比例的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

底物TSS的影響：TSS分別取10、20、30、40、50和60oBrix，其他因素取值：酶添加量9 U/g、底物pH 6.0、溫度55 ℃下反應(yīng)時(shí)間5 h。

pH的影響：用檸檬酸調(diào)不同的pH值，分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他因素取值：酶添加量9 U/g、底物TSS 30oBrix、55 ℃下轉(zhuǎn)化反應(yīng)5 h。

酶添加量的影響：根據(jù)底物中蔗糖的質(zhì)量設(shè)置不同的酶添加量（即每克蔗糖對應(yīng)的酶活力單位U：0.6、1.2、2.4、6.0、9.0和12.0 U/g），其他因素取值：pH 6.0、溫度55 ℃、底物TSS 30oBrix、反應(yīng)時(shí)間5 h。

因此，為保證新舊道床聯(lián)結(jié)可靠，在預(yù)制的新短軌枕底部設(shè)預(yù)埋鋼筋鉤，以加強(qiáng)短軌枕與道床之間的聯(lián)結(jié)。同時(shí)，澆筑強(qiáng)度等級不低于原道床強(qiáng)度的砂漿，該砂漿具有快凝、早強(qiáng)的性能。另外，在施工過程中，采用“解體無縫線路，拆除既有軌枕及套靴、原位換鋪扣件及軌枕、灌注砂漿”的施工方法對軌道進(jìn)行改造施工，以“隔三換一”的原則進(jìn)行短軌枕更換，同時(shí)在軌道改造期間應(yīng)限速，并且協(xié)調(diào)配合多專業(yè)，多重把控安全質(zhì)量，以確保改造施工的安全和質(zhì)量。

溫度的影響：設(shè)置不同的作用溫度35、45、55、65和75 ℃，其他因素取值：酶添加量9 U/g、底物TSS 30oBrix、底物pH 6.0、反應(yīng)時(shí)間5 h。

時(shí)間的影響：設(shè)置不同的轉(zhuǎn)化作用時(shí)間0、1、3、5、7、9 h，其他因素取值：酶添加量9 U/g、底物TSS 30oBrix，pH 6.0、溫度55 ℃。

1.4 果汁中的糖分的分析方法

參照胡志群等[28]人的測定方法，采用高效液相色譜儀測定果汁中蔗糖、葡萄糖、果糖、低聚果糖等糖分組成及各組分含量，具體參數(shù)條件如下：

高效液相色譜分析條件：選用島津LC-20AT高效液相色譜儀，配有RID示差檢測器，色譜柱為NH2P-50 4E氨基柱（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為乙腈（V）：水（V）=70：30，流速為1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制系列溶度的蔗糖、葡萄糖、果糖、GF2、GF3、GF4標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過液相色譜分析測定，制定標(biāo)準(zhǔn)物濃度與峰面積關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理：準(zhǔn)確移取龍眼果汁樣品6 mL于100 mL容量瓶中，加入80%（體積比）的乙醇80 mL，在超聲波振蕩器中處理30 min，3500 r/min離心40 min，收集上清液，沉淀重復(fù)用同量的乙醇及超聲波處理1～2次，離心收集上清液。合并上清液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至乙醇和水分將近全干，然后用蒸餾水定容至25 mL的容量瓶中，4 ℃冰箱中放置過夜，離心取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液供分析用。

蔗糖轉(zhuǎn)化率（%）=（酶處理前果汁蔗糖含量-酶處理后果汁蔗糖含量）/酶處理前果汁蔗糖含量×100%。

低聚果糖（FOS）含量=蔗果三糖（GF2）+蔗果四糖（GF3）+蔗果五糖（GF4），單位為mg/mL。

低聚果糖（FOS）比例（%）=低聚果糖含量/總糖含量×100%。

總糖含量=蔗糖含量+葡萄糖含量+果糖含量+低聚果糖含量，單位：mg/mL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0和Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，組間均值比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA)和Tukey’s兩兩比較分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，平均顯著水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物TSS對酶轉(zhuǎn)化龍眼果汁中產(chǎn)物的影響

在酶添加量9 U/g、pH 6.0、溫度55 ℃下反應(yīng)時(shí)間5 h，設(shè)置不同的底物TSS（10、20、30、40、50和60

oBrix），探討底物TSS不同對龍眼果汁中蔗糖的轉(zhuǎn)化和生成低聚果糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1。由圖可知，隨著底物濃度的提高，經(jīng)過酶的作用轉(zhuǎn)化了部分蔗糖，生成低聚果糖的量會(huì)顯著增加（p＜0.05）。底物濃度從40oBrix提高到60oBrix，雖然低聚果糖含量也明顯增加，但果汁中的蔗糖含量因濃縮的原因隨濃縮倍數(shù)的增加而增加，同時(shí)蔗糖的轉(zhuǎn)化率顯著降低（p＜0.05），低聚果糖占果汁中的總糖比例并沒有提高。因此，考慮到實(shí)際操作，龍眼果汁的底物TSS選擇在30～40

oBrix為較適合。

圖1 底物TSS對龍眼果汁中蔗糖轉(zhuǎn)化(a)和FOS產(chǎn)量(b)的影響Fig.1 Influence of TSS on sucrose conversion and FOS production in longan juice

2.2 pH對酶轉(zhuǎn)化龍眼果汁中產(chǎn)物的影響

在酶添加量9 U/g、底物TSS 30oBrix、55 ℃下轉(zhuǎn)化反應(yīng)5 h，設(shè)置pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，探討不同pH值對龍眼果汁中蔗糖的轉(zhuǎn)化和低聚果糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖2所示。在pH 5.0～6.0范圍，蔗糖含量明顯減少，轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值，在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)，低聚果糖的產(chǎn)量及其占總糖比例達(dá)最大值，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH＜5.0和pH＞7.0的范圍，蔗糖轉(zhuǎn)化率、低聚果糖含量及其占總糖的比例顯著降低（p＜0.05）。據(jù)參考文獻(xiàn)[29]報(bào)道果糖的轉(zhuǎn)移酶的最適pH是5.5～6.5，當(dāng)pH＞7.0之后果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性受到抑制，蔗糖轉(zhuǎn)化率明顯降低，底物中蔗糖含量較高?？紤]龍眼果汁自身的pH和果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)特性，選擇pH 6.0較適合。

圖2 不同pH對龍眼果汁中蔗糖的轉(zhuǎn)化(a)和FOS產(chǎn)量(b)的影響Fig.2 Influence of pH on sucrose conversion and FOS production in longan juice

2.3 酶添加量對酶轉(zhuǎn)化果汁中產(chǎn)物的影響

以果汁中蔗糖的含量為基準(zhǔn)，根據(jù)果汁中蔗糖的質(zhì)量設(shè)置不同的酶添加量（即每克蔗糖對應(yīng)的酶活力單位U：0.6、1.2、2.4、6.0、9.0和12.0 U/g），在pH 6.0、溫度55 ℃、底物TSS 30oBrix、反應(yīng)時(shí)間5 h下，研究酶添加量對龍眼果汁中蔗糖的轉(zhuǎn)化和低聚果糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。

如圖3中所示隨著酶添加量的增加，果汁中蔗糖含量顯著降低（p＜0.05），同時(shí)低聚果糖的產(chǎn)量會(huì)迅速增加，在添加量為9～12 U/g時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率、低聚果糖含量及其占總糖的比例達(dá)到最大值。根據(jù)酶促反應(yīng)作用，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶濃度時(shí)，酶的反應(yīng)速度與酶濃度呈正比，但當(dāng)?shù)孜锱c酶的活力中心結(jié)合飽和后，反應(yīng)速度就不再增加[30]。因此在酶添加量較少時(shí)隨著酶添加量的增加，低聚果糖生成量會(huì)迅速增加，但酶添加量在9 U/g以上時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率和低聚果糖生成量已沒有顯著增加。因此，酶的添加量范圍在9～12 U/g為佳。

圖3 酶添加量對龍眼果汁中蔗糖轉(zhuǎn)化(a)和FOS產(chǎn)量(b)的影響Fig.3 Influence of enzyme concentration on sucrose conversion and FOS production in longan juice

2.4 溫度對酶轉(zhuǎn)化果汁中產(chǎn)物的影響

在酶添加量9 U/g、底物TSS 30oBrix、pH 6.0、反應(yīng)時(shí)間5 h下，設(shè)置不同的溫度（35、45、55、65和75 ℃），探討不同的溫度對龍眼果汁中蔗糖的轉(zhuǎn)化和低聚果糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著反應(yīng)溫度從35 ℃升高至55 ℃，果汁中蔗糖顯著減少，轉(zhuǎn)化率顯著提高，低聚果糖的含量及其比例顯著增加達(dá)到最大值。當(dāng)溫度從65 ℃提高至75 ℃時(shí)，蔗糖的轉(zhuǎn)化明顯受到抑制，低聚果糖的含量及其比例也顯著下降。這說明果糖基轉(zhuǎn)移酶在45～65 ℃的溫度范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性良好，但在75 ℃的條件下活性明顯受到抑制。不同來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性及最適溫度會(huì)有所不同。

余軒等[31]研究米曲霉來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)現(xiàn)其最適溫度范圍是20～50 ℃，當(dāng)溫度高于70℃時(shí)酶活基本全部喪失，李慧娟等[32]研究了耶氏酵母細(xì)胞來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定溫度范圍是45～55℃，且最適溫度是45℃。王一恬等[33]將黑曲霉YZ59果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)到釀酒酵母細(xì)胞上，生產(chǎn)出的果糖基轉(zhuǎn)移酶最適反應(yīng)溫度為55 ℃。本研究所用果糖基轉(zhuǎn)移酶來源于棘孢曲霉菌株發(fā)酵，與上述研究相比其具有更廣泛的熱穩(wěn)定范圍。綜上所述，酶轉(zhuǎn)化溫度選擇為55 ℃較合適。

圖4 不同溫度對龍眼果汁中蔗糖轉(zhuǎn)化(a)和FOS產(chǎn)量(b)的影響Fig.4 Influence of temperature on sucrose conversion and FOS production in longan juice

2.5 反應(yīng)時(shí)間對酶轉(zhuǎn)化果汁中產(chǎn)物的影響

在酶添加量9 U/g、底物TSS 30oBrix，pH 6.0、溫度55 ℃下，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間下（0、1、3、5、7、9 h），探討反應(yīng)時(shí)間對龍眼果汁中蔗糖的轉(zhuǎn)化和生成低聚果糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。在反應(yīng)初期至5 h，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長果汁中的蔗糖含量顯著降低，蔗糖轉(zhuǎn)化率迅速提高，顯著生成低聚果糖（p＜0.05）。反應(yīng)至7 h后，隨時(shí)間的增加，蔗糖含量和蔗糖轉(zhuǎn)化率變化不顯著，低聚果糖含量及其比例趨于穩(wěn)定。酶處理時(shí)間選擇5～9 h較合適。

圖5 酶處理時(shí)間對龍眼果汁中蔗糖轉(zhuǎn)化(a)和FOS產(chǎn)量(b)的影響Fig.5 Influence of reaction time on sucrose conversion and FOS production in longan juice

2.6 酶處理對果汁中糖組分的影響

圖6 酶轉(zhuǎn)化前后龍眼果汁中單糖、蔗糖及低聚糖組成的液相色譜圖Fig.6 The liquid chromatogram of monosaccharides, sucrose and oligosaccharides in longan juice before and after enzymatic treatment

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取底物總可溶性固形物為30oBrix龍眼果汁，酶添加量9 U/g，pH 6.0，在55 ℃下處理7 h的樣品，采用高效液相色譜法對酶處理前后的龍眼果汁中單糖、蔗糖和低聚果糖等組分進(jìn)行分析，結(jié)果見表1和圖6。

結(jié)果表明，酶轉(zhuǎn)化前底物TSS為30oBrix的龍眼濃縮果汁中以蔗糖為主，含量為164.36 mg/mL，果糖的含量為42.52 mg/mL、葡萄糖的含量為49.27 mg/mL，沒有檢測到低聚果糖。酶轉(zhuǎn)化7 h所得龍眼果汁中蔗糖的含量顯著減少至22.34 mg/mL，果糖的含量為37.73 mg/mL，葡萄糖的含量為98.22 mg/mL，檢測到蔗果三糖和蔗果四糖，含量分別為70.50 mg/mL和27.38 mg/mL，低聚果糖含量為97.88 mg/mL。結(jié)果表明，經(jīng)酶轉(zhuǎn)化之后龍眼果汁中蔗糖的含量顯著減少了86.41%，新生成的低聚果糖占果汁中總糖的比例為38.21%。同時(shí)值得注意的是果汁中葡萄糖含量也會(huì)增加。Roberto等[34]人用一種商業(yè)酶轉(zhuǎn)化蔗糖制備低聚果糖，也得到了類似了結(jié)果，隨著反應(yīng)的進(jìn)行葡萄糖會(huì)積累，且葡萄糖積累到一定量之后會(huì)抑制低聚果糖的生成。因此，后續(xù)的研究工作需要考慮降低果汁中葡萄糖的含量，使果汁中的低聚果糖含量和比例得到進(jìn)一步的提高。當(dāng)然，龍眼果汁在55 ℃處理7 h，除了糖組分產(chǎn)生變化外，因美拉德反應(yīng)，顏色和風(fēng)味等感官指標(biāo)會(huì)發(fā)生變化，如顏色加深，顯現(xiàn)出干制龍眼的香味物質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。

表1 酶處理前后的龍眼果汁中糖組分的變化和含量Table 1 The sugars composition in longan juice before and after enzymatic treatment

3 結(jié)論

底物濃度（TSS）、pH、酶添加量、溫度和酶處理時(shí)間等單因素對龍眼果汁中蔗糖和低聚果糖含量有顯著影響，其中較適合的酶轉(zhuǎn)化條件為：龍眼果汁的底物TSS為30～40oBrix，pH 6.0，酶的添加量范圍在9～12 U/g，酶轉(zhuǎn)化溫度55 ℃，酶處理時(shí)間5～9 h。在此條件范圍之內(nèi)，果糖基轉(zhuǎn)移酶能夠有效將龍眼果汁中的蔗糖轉(zhuǎn)化生成低聚果糖，且使蔗糖的轉(zhuǎn)化率和低聚果糖比例分別能夠保持在80%以上和38%以上；HPLC分析結(jié)果表明30oBrix的龍眼濃縮果汁，酶轉(zhuǎn)化前蔗糖含量為164.36 mg/mL、果糖的含量為42.52 mg/mL、葡萄糖的含量為49.27 mg/mL，沒有檢測到低聚果糖，在酶添加量9 U/g、pH 6.0、55 ℃下轉(zhuǎn)化7 h的龍眼果汁，蔗糖顯著降低，其含量為22.34 mg/mL，果糖的含量為37.73 mg/mL，葡萄糖含量為98.22 mg/mL，蔗果三糖含量為70.50 mg/mL，蔗果四糖含量為27.38 mg/mL，低聚果糖的總含量為97.88 mg/mL，占果汁中總糖的38.21%。利用果糖基轉(zhuǎn)移酶處理果汁制備一種低蔗糖（低熱量）且富含低聚果糖的具有潛在益生元作用的功能性龍眼果汁。