路榮忠，許曉松，孫克濤

(1．淄博市中心醫(yī)院，山東淄博 255031；2．山東百?；蚩萍加邢薰荆綎|淄博 255000)

色素失禁癥(incontinentia pigmenti，IP)是一種罕見的X連鎖顯性遺傳性皮膚病，多見于女性，男性患兒通常在宮內(nèi)死亡[1]。色素失禁癥的臨床癥狀主要表現(xiàn)為皮膚損害，而且伴有牙齒、神經(jīng)系統(tǒng)和眼睛等病變[2]，該病在新生兒早期多以皮膚損害為首發(fā)癥狀。IP的主要致病基因?yàn)镹F-κB必須調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB-essential modulator，NEMO)，又稱IKBKG基因。NEMO基因長度為23 kb，包含10個(gè)外顯子和3個(gè)交替出現(xiàn)的非編碼的第一外顯子，共編碼415個(gè)氨基酸。NEMO基因下游35.5 kb重復(fù)區(qū)域中存在一個(gè)高度同源的假基因ΔNEMO，序列排列方向與NEMO基因相反[3]。目前約80%的IP可找到基因突變，其中NEMO基因共有序列NEMO△4～10缺失可以導(dǎo)致60%～80%的IP[4]。本文對1個(gè)IP家系的NEMO序列進(jìn)行檢測分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 臨床資料

1.1.1.1 先證者：女，2.5歲，早期紅斑、水皰?，F(xiàn)左右胸口處留有片狀淡褐色不規(guī)則色素沉著，右腿留有旋渦狀淡褐色色素沉著，左腿有典型水泡遺留色素沉著。眼失明，聾、啞，骨骼發(fā)育異常(不會(huì)走路、手不能握拳)，被診斷為IP。

1.1.1.2 先證者父親：男，30歲，身體健康。

1.1.1.3 先證者母親：女，27歲，視力：CF/30cm，生育二女，三胎懷孕4個(gè)月自然流產(chǎn)一男胎。

1.1.1.4 先證者姐姐：女，7歲，身體健康。

1.1.1.5 先證者外祖母：女，55歲，視力：雙眼HM/10cm，貧血貌，其余正常，生育一女。

1.1.1.6 健康對照：女，36歲，身體健康，與該家系無血緣關(guān)系。

1.1.2 遺傳家系圖譜：見圖1。根據(jù)臨床資料繪制該家系的遺傳家系圖譜。

圖1 遺傳家系圖譜

1.2 方法

1.2.1 DNA提?。航?jīng)患者及家屬、健康對照知情同意后，分別抽取所有成員外周靜脈血2 ml于EDTA-K2抗凝管，采用全血基因組DNA提取試劑盒(百泰克公司)提取基因組DNA，-20℃保存。

1.2.2 目的片段擴(kuò)增：參照文獻(xiàn)[5]的方法，采用跨越斷裂點(diǎn)方法鑒定NEMO和△NEMO基因特異性缺失，引物由北京中美泰和公司合成。

1.2.2.1 NEMO基因引物：上游：In2，5’-GAGGACCAATACCGAGCATC-3’，下游：JF3R，5’-CTCGGAGACACAGGAACCAGCA- 3’。

1.2.2.2 △NEMO基因引物：上游：Rev2，5’-GCCATCTGITFFFGCGTGTG-3’，下游：JF3R，5’-CTCGGAGACACAGGAACCAGCA-3’。引物In2，JF3R擴(kuò)增片段長度為2.6kb，說明NEMO基因特異性缺失；引物Rev2，JF3R擴(kuò)增片段長度為2.5kb，說明ΔNEMO基因特異性缺失[5]。未缺失者無法擴(kuò)增出目的片段。原理見圖2。

圖2 特異性引物及擴(kuò)增片段示意圖

50 μl PCR反應(yīng)體系如下：滅菌超純水(UPW)17 μl，PCR Mix(百泰克公司)25 μl，上游引物(25 μmol/μl)1.5 μl，下游引物(25 μmol/μl)1.5 μl，模板DNA5 μl。

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，NEMO基因60℃/△NEMO基因58℃復(fù)性1min，68℃延伸4 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物電泳：擴(kuò)增后的產(chǎn)物于2 g/dl瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)束后用凝膠成像掃描儀(美國伯樂)觀察目的條帶并拍照保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序：對1.2.3所得三個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序以確定突變位點(diǎn)，由北京中美泰和公司提供測序引物并完成測序。

1.2.5 血細(xì)胞檢測：用日本SysMex XN-1000對所采血樣進(jìn)行血細(xì)胞檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 見圖3。

M：DNA Marker；A1，A2，A3，A4，A5，A6分別代表外祖母、父親、母親、姐姐、先證者及健康對照的NEMO基因擴(kuò)增片段；B1，B2，B3，B4，B5，B6分別代表外祖母、父親、母親、姐姐、先證者及健康對照的△NEMO基因擴(kuò)增片段。

圖3 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

電泳結(jié)果顯示先證者及其母親、外祖母均能觀測到引物In2，JF3R擴(kuò)增的2.6kb大小的片段，其父親、姐姐和健康對照未見該目的片段。所有家系成員及健康對照均未觀測到引物Rev2，JF3R擴(kuò)增的2.6 kb大小的片段。

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 對先證者及其外祖母、母親的NEMO基因特異性缺失擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果見圖4。三人均未檢測到斷裂點(diǎn)Ⅰ，Ⅱ之間的序列(圖2)，測序圖中箭頭所指位置的左側(cè)為斷裂點(diǎn)Ⅰ左側(cè)的序列，右側(cè)為斷裂點(diǎn)Ⅱ右側(cè)的序列，說明三人均有NEMO基因外顯子4-10的缺失。

2.3 血細(xì)胞檢測 所有家族成員及健康對照者白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類均未見明顯異常，血細(xì)胞分析儀和涂片瑞氏染色也未發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增多，僅有先證者外祖母的Hb為34 g/L，接近重度貧血。

S：NEMO基因斷裂點(diǎn)附近的標(biāo)準(zhǔn)序列；A1，A3，A5分別代表外祖母、母親、先證者的NEMO基因部分測序結(jié)果，箭頭指示位置為斷裂點(diǎn)。

3 討論

色素失禁癥最早于1906年由Garrod研究報(bào)道，是X染色體顯性遺傳病。女性有兩個(gè)X染色體，雜合子患者由于X-染色體失活偏移可以存活，并表現(xiàn)出不同程度的表型癥狀；男性僅有一條X染色體，不存在X-染色體失活偏移，通常會(huì)在胎兒期死亡，存活的男性IP患者多為NEMO基因點(diǎn)突變導(dǎo)致[6]，還有幾例為47-XXY性染色體異常型(Klinefelter綜合征)或者存活男性為存在正?；蚝蚇EMO△4-10缺失的嵌合體[6～8]。由于該癥可導(dǎo)致智力發(fā)育遲緩、神經(jīng)系統(tǒng)損害、眼睛、牙齒等發(fā)育異常，因此臨床需提高對該病的認(rèn)識。IP女性患者表型差異隨個(gè)體變化很大，除造成皮膚損傷外，還會(huì)在皮膚附屬物(脫發(fā)和指甲營養(yǎng)不良)、牙齒(個(gè)別牙缺失、小牙畸形、推遲生齒、錐形牙齒)、口腔(小頜畸形、凸頜、高腭)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(癲癇、精神發(fā)育遲滯、頭小畸型)、眼(視網(wǎng)膜脫離、色素性視網(wǎng)膜病變、晶狀體后發(fā)育不良、斜視、白內(nèi)障)和血液(嗜酸性粒細(xì)胞增多)等方面出現(xiàn)臨床癥狀[2]。本文先證者已出現(xiàn)皮膚、眼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等的損傷，其母親和外祖母除眼睛視力障礙外尚未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)的損傷，血細(xì)胞常規(guī)檢查也未發(fā)現(xiàn)明顯異常，未見嗜酸性粒細(xì)胞增多。

本次研究應(yīng)用Bardaro等[5]的方法，在NEMO基因內(nèi)含子2和△NEMO基因外顯子3的外側(cè)設(shè)計(jì)上游引物，分別對NEMO基因或△NEMO基因特異性缺失進(jìn)行鑒定，此方法已在其他研究中驗(yàn)證其準(zhǔn)確度和實(shí)用性[3，7，10]。此次檢測結(jié)果顯示：先證者及其母親和外祖母均存在NEMO基因4-10特異性缺失，其父親、姐姐和健康對照者未見該缺失；所有家系成員及健康對照者均未檢測到△NEMO缺失。先證者的NEMO基因4-10特異性缺失遺傳自其母親，檢測結(jié)果符合該家系臨床癥狀，NEMO基因外顯子4-10缺失是先證者的致病基因突變。目前約80%的IP患者可以找到其致病基因，另外的20%尚未明確病因，所以對發(fā)現(xiàn)病例進(jìn)行深入分析研究有重要意義。在已發(fā)現(xiàn)的可導(dǎo)致IP的基因突變中，NEMO基因共有序列 NEMO△4-10缺失占60%～80%[4]，10%為微缺失、點(diǎn)突變[9]。近年來已經(jīng)證實(shí)NEMO基因?yàn)樯厥ЫY致病基因，將有助于解決該癥診斷困難的難題。NEMO基因突變分析還可提供產(chǎn)前診斷技術(shù)，值得應(yīng)用和推廣。