弓添添，肖美娟，陳 櫻，何鈺書，王 普

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

0 引言

肺癌是全世界最常見(jiàn)且發(fā)病率最高的惡性腫瘤。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球范圍內(nèi)每年有180萬(wàn)的新發(fā)病例和160萬(wàn)的死亡病例；在我國(guó)，隨著環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，每年新發(fā)病例為67.7萬(wàn)，致死人數(shù)達(dá)56.5萬(wàn)，均為世界癌癥患病率和死亡率排行榜第一[1]。肺癌分為兩類：非小細(xì)胞肺癌（NSCLC，占85%左右）和小細(xì)胞肺癌（SCLC，占15%左右）[2-4]。分子靶向藥物是目前治療非小細(xì)胞肺癌的首選藥物，相對(duì)于傳統(tǒng)的化療具有更高的選擇性，且毒副作用小[5]。

克唑替尼（Crizotinib，XalkoriR），化學(xué)名稱為3-[（R）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙氧基]-5-[1-（哌啶-4-基）-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-胺，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，相對(duì)分子質(zhì)量為 450.34，分子式為C21H22Cl2FN5O，性狀為白色至淺黃色粉末[6]?？诉蛱婺嵬ㄟ^(guò)選擇性競(jìng)爭(zhēng)三磷酸腺苷（ATP），阻斷激酶蛋白來(lái)發(fā)揮作用，使細(xì)胞停留在G1-S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。該藥物2011年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，成為全球第一個(gè)口服的EML4-ALK融合基因抑制劑，也推動(dòng)了分子靶向藥物向個(gè)體化治療的發(fā)展。制備克唑替尼的難點(diǎn)和關(guān)鍵在于其關(guān)鍵手性中間體 （S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的合成。本文主要綜述了克唑替尼關(guān)鍵手性中間體 （S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的合成方法，包括生物酶法，化學(xué)合成法，手性拆分法，酶偶聯(lián)催化，挖掘新型酮還原酶催化以及微生物全細(xì)胞催化。

圖1 藥物克唑替尼結(jié)構(gòu)式Figure 1 The structural formula of Crizotinib

1 生物酶法

Pei-Pei Kung[9]報(bào)道了以 2，6-二氯-3-氟苯乙酮（化合物1）為起始原料，通過(guò)NaBH4、甲醇還原后制得消旋體2，該消旋體2經(jīng)過(guò)酯化反應(yīng)得到酯類化合物3，繼而利用豬肝酯酶水解酯類化合物3得到S型和R型手性中間體4。最后將得到的R型中間體4在LiOH和甲醇體系中轉(zhuǎn)化為單一S構(gòu)型的手性醇（圖2）。該方法所得產(chǎn)物ee值為97%，但由于生物酶不易獲得，價(jià)格昂貴，反應(yīng)條件苛刻易失活，反應(yīng)步驟多，周期長(zhǎng)，收率低等限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

圖2 豬肝酯酶酶法合成（S）-醇Figure 2 Synthesis of（S）-alcohol by pig liver esterase （PLE）

2 化學(xué)合成

唐虹[10]報(bào)道了化學(xué)合成方法，以2，6-二氯-3-氟苯乙酮為起始原料，在溶劑中通過(guò)有機(jī)小分子催化劑（S）-二甲苯基脯氨醇，在還原劑金屬硼氫化鈉和三甲基氯硅烷的作用下，經(jīng)不對(duì)稱還原得到（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇，收率為98%，ee值為96%，該方法克服了原有技術(shù)中采用生物酶催化步驟多，周期長(zhǎng)和化學(xué)拆分法收率低等缺點(diǎn)，具有成本低、操作簡(jiǎn)便、收率高、光學(xué)純度好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

Qian Jian-Qiang等[11]報(bào)道了利用 Ir[（R）-DTB-spiro-PAP-3-Me]銥吡啶氨基膦化氫為催化劑，以2，6-二氯-3-氟苯乙酮為起始原料，在叔丁醇鉀，無(wú)水乙醇和氫氣體系下不對(duì)稱催化合成（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇（見(jiàn)圖 3），該方法的轉(zhuǎn)化率高，ee值為99.5%，但銥催化劑（CAS：1418483-59-6）無(wú)市售，因此限制了該合成路線的應(yīng)用。

3 手性拆分

孫學(xué)英[12]等采用Boc-L-脯氨酸（N-叔丁氧基羰基-L-脯氨酸）與催化劑對(duì)甲苯磺酸和縮合劑1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽相組合的催化拆分方法制得S型產(chǎn)物。該路線以2，6-二氯-3-氟苯乙酮（化合物6）為起始原料，經(jīng)水解制得消旋體1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇（化合物7），將消旋體（化合物7）拆分為S-型醇和R-型醇（化合物8），隨后將拆分副產(chǎn)物混合物（化合物8，化合物9，化合物 10）水解得到S-型醇和R-型醇（化合物11），而后將R-型醇（化合物11）與三苯基磷和偶氮二甲酸二乙酯相組合選擇性的進(jìn)行Mitsunobu反應(yīng)，產(chǎn)物（化合物12）再經(jīng)過(guò)氫氧化鈉水解，結(jié)晶分離提純制得（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇（見(jiàn)圖4），縮短了反應(yīng)時(shí)間，減少了污染，易于工業(yè)化實(shí)施，但總收率較低。

圖3 金屬催化制備（S）-醇Figure 3 Synthesis of（S）-alcohol by metal as catalyst

4 酶偶聯(lián)法催化

郭紅顏等[13]利用基因工程的方法，以洛德酵母（Lodderomyces sp.）基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到甲酸脫氫酶（FDH）基因，導(dǎo)入載體pET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFDH-pET28a，并構(gòu)建乙醇脫氫酶（ADH） 表達(dá)質(zhì)粒 pADH-pET21a，與 pFDH-pET28a 共 同 轉(zhuǎn) 入 E.coli BL21 （DE3）（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇（見(jiàn)圖 5），產(chǎn)物純度為100%，收率50%以上。

劉麗勤[14]構(gòu)建重組大腸桿菌E.coli BL21-ADH和E.coli BL21-GDH，實(shí)現(xiàn)葡萄糖脫氫酶和乙醇脫氫酶的共表達(dá)，進(jìn)行酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化（圖6）。結(jié)果表明，在反應(yīng)溫度為 30℃，pH=7下，（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的產(chǎn)量最高，在投料量為6%時(shí)，轉(zhuǎn)化率為93.75%。

圖4 手性拆分制備（S）-醇Figure 4 Synthesis of（S）-alcohol by chiral resolution

圖5 乙醇脫氫酶偶聯(lián)甲酸脫氫酶制備（S）-醇Figure 5 Synthesis of（S）-alcohol by coupling alcohol dehydrogenase and formate dehydrogenase

圖6 共表達(dá)乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶制備（S）-醇Figure 6 Synthesis of（S）-alcohol by coexpression of alcohol dehydrogenase and glucose dehydrogenase

5 新型酮還原酶的挖掘

魏東芝[15]以2，6二氯-3-氟苯乙酮為底物進(jìn)行酶的篩選，從酶庫(kù)中篩選到可完全轉(zhuǎn)化底物且產(chǎn)物為S構(gòu)型手性醇，ee值大于99.5%的開菲爾乳酸菌酮還原酶（KRED82，Lactobacillus）（圖 7）。當(dāng)?shù)孜餄舛葹? M （621 g/L）時(shí)，反應(yīng)24 h后底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.5%。

圖7 利用酮還原酶合成（S）-醇Figure 7 Synthesis of（S）-alcohol by ketoreductase

6 微生物全細(xì)胞催化

筆者所在實(shí)驗(yàn)室[16]篩選得到一株白地霉（Geotrichum candidum）ZJPH1704， 可用于高選擇性催化底物2，6-二氯-3-氟苯乙酮合成 （S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇。底物濃度 1 g/L，200 g/L菌體量（濕重），于 40℃下反應(yīng) 24 h，產(chǎn)率達(dá)93%，ee值大于99.9%。利用全細(xì)胞催化具有反應(yīng)條件溫和，催化劑性能穩(wěn)定且不易失活，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。

7 結(jié)論與展望

近年來(lái)，隨著人們的物質(zhì)生活水平快速提升，癌癥的發(fā)病率也逐年提高，肺癌作為發(fā)病率和致死率第一的癌癥，對(duì)人類的健康存在巨大威脅?？诉蛱婺崾悄壳胺切〖?xì)胞肺癌的首選治療藥，有著較好的市場(chǎng)前景，因此其研究開發(fā)上市和制備技術(shù)的發(fā)展受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前對(duì)于克唑替尼的制備技術(shù)雖然已較為成熟但仍為化學(xué)方法合成，反應(yīng)過(guò)程中存在副產(chǎn)物多，步驟較為繁瑣，環(huán)境不友好等問(wèn)題，所以在克唑替尼的制備技術(shù)開發(fā)方面仍值得研究。利用生物催化法制備克唑替尼具有高效、光學(xué)純度高、環(huán)境友好，以及其在化合物合成上能避免一些化學(xué)法所必須的苛刻條件等優(yōu)勢(shì)，使得生物催化法受到廣泛地關(guān)注，如何將生物法更好地運(yùn)用于克唑替尼制備的工藝路線中是未來(lái)研究的方向。