李鑫 馬建華 戴宜武

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，呈侵襲性生長，惡性程度高。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤血管生成的重要因子，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[1]。Sox-2 基因是 SOX 家族中的一員，是維持膠質(zhì)瘤干性的重要基因[2，3]。趨化因子受體CXCR4可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的生長和血管生成[4]。本研究采用組織免疫熒光法，檢測不同病理分級腦膠質(zhì)瘤中VEGF，Sox-2 和CXCR4表達(dá)情況及相互之間的關(guān)系，為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 本實(shí)驗40例腦膠質(zhì)瘤石蠟包埋標(biāo)本來自陸軍總醫(yī)院病理科2013～2014年存檔病理蠟塊，男23例，女17例，其中低度惡性膠質(zhì)瘤（I～Ⅱ級）22例，高度惡性膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級）18例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療。正常腦組織標(biāo)本10 例（對照組），為急性顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)切除的腦組織。

1.2 主要試劑 小鼠抗人VEGF，小鼠抗人Sox-2，兔抗人CXCR4均購自英國Abcam公司，石蠟切片機(jī)（德國萊卡公司）。

1.3 免疫組織熒光染色 包埋好的標(biāo)本用石蠟切片機(jī)切片，厚度為5μm，并將蠟片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上。置于60℃烘箱烘4h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，切片置于0.1mol/L pH=6.0的枸櫞酸液修復(fù)液中，微波煮沸10～20min進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫下冷卻20min，3%H2O2溶液處理10min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS 洗5min×3次，滴加血清封閉，濕盒中37℃封閉30min。傾去血清，4℃過夜孵育一抗（VEGF、Sox-2、CXCR4），PBS洗3次。滴加二抗于濕盒中37℃避光孵育2h，滴加DAPI 避光孵育2min，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用卡方檢驗及相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、Sox-2、CXCR4在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)VEGF、Sox-2、CXCR4在對照組無陽性表達(dá)（見圖1），而在各級別腦膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)（見圖2～4）。

2.2 VEGF、Sox-2、CXCR4表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤分級的關(guān)系 高度惡性腦膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級）和低度惡性腦膠質(zhì)瘤（Ⅰ～Ⅱ級）相比，VEGF、Sox-2、CXCR4的表達(dá)有顯著差異（P＜0.05，見圖2～4、表1）。

圖1 VEGF、Sox-2、CXCR4在正常腦組織中的表達(dá)（×200）

圖2 VEGF在各級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（×200）

圖3 Sox-2在各級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（×200）

圖4 CXCR4在各級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（×200）

表1 VEGF、Sox-2、CXCR4在高度和低度惡性腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)量比較（±s）

表1 VEGF、Sox-2、CXCR4在高度和低度惡性腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)量比較（±s）

惡性度 VEGF Sox-2 CXCR4低度惡性腦膠質(zhì)瘤 12.46±0.52 18.68±0.63 10.56±0.49高度惡性腦膠質(zhì)瘤 38.35±0.78 42.15±0.35 35.46±0.56 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 VEGF、Sox-2、CXCR4的表達(dá)相關(guān)性 腦膠質(zhì)瘤VEGF陽性細(xì)胞百分率與Sox-2呈顯著正相關(guān)（r1=0.733，P＜0.05）；VEGF 陽性細(xì)胞百分率與CXCR4 也呈顯著正相關(guān)（r2=0.735，P＜0.05）；Sox-2陽性細(xì)胞百分率與CXCR4亦呈顯著正相關(guān)（r3=0.771，P＜0.05）。

3 討論

腦腫瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中嚴(yán)重危害人類健康和生命的一類疾病，而膠質(zhì)瘤是腦腫瘤中發(fā)病率最高且預(yù)后最差的腫瘤[5]。膠質(zhì)瘤的侵襲性是膠質(zhì)瘤的主要生物學(xué)特性，腦膠質(zhì)瘤的侵襲性與其惡性度密切相關(guān)。因此，應(yīng)用某些分子標(biāo)志物對膠質(zhì)瘤進(jìn)行準(zhǔn)確的分級診斷，對今后的臨床治療和預(yù)后有非常重要的指導(dǎo)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF、Sox-2及CXCR4在人膠質(zhì)瘤中顯著表達(dá)，且VEGF、Sox-2及CXCR4的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤分級的增高而增多，在高度惡性膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級）中表達(dá)明顯比低級別（Ⅰ～Ⅱ級）多，與文獻(xiàn)報道[6～8]的研究結(jié)果一致。VEGF、Sox-2及CXCR4三者表達(dá)呈正相關(guān)，在某種程度上反映膠質(zhì)瘤的分級與其惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，VEGF、Sox-2及CXCR4可能成為判斷膠質(zhì)瘤惡性程度的重要指標(biāo)。但三者之間在膠質(zhì)瘤的病理進(jìn)展中的相互關(guān)系尚未報道。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的生長、浸潤與轉(zhuǎn)移和腫瘤的血供之間有密切的關(guān)系，腦膠質(zhì)瘤是血管豐富的腫瘤，與血管生成密切相關(guān)[9]，VEGF、Sox-2及CXCR4三者可能通過膠質(zhì)瘤血管生成和細(xì)胞增殖兩個方面起作用。從作用機(jī)制上分析，VEGF 與CXCR4都與膠質(zhì)瘤血管形成有關(guān)。VEGF 是一種具有高度特異性的血管內(nèi)皮成分，它能夠增加血管生成的數(shù)量和增加血管的通透性；VEGF 通過刺激腫瘤微血管生長而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生長[10]；CXCR4是一種趨化因子受體，研究已發(fā)現(xiàn)其在腫瘤誘導(dǎo)血管的生成中起重要作用，與腦膠質(zhì)瘤微血管生成有著密切的關(guān)系[11]，CXCR4可誘導(dǎo)腫瘤向周圍組織浸潤[12]。Sox-2可以誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，維持干細(xì)胞的特性，證據(jù)顯示腦腫瘤干細(xì)胞表達(dá)Sox-2[13，14]，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的不斷增殖靠Sox-2來維持。三者之間相互聯(lián)系，相互影響。大量新生血管為膠質(zhì)瘤細(xì)胞的快速增殖、生長提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[15]，腫瘤組織不斷出現(xiàn)新生血管為腫瘤細(xì)胞增殖提供了營養(yǎng)渠道，因此膠質(zhì)瘤不斷地保持增殖活性和侵襲能力。

膠質(zhì)細(xì)胞瘤的分級是判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療的指標(biāo)。VEGF、Sox-2及CXCR4的檢測可以幫助鑒定膠質(zhì)瘤的惡性度，為其分級提供輔助、客觀的指標(biāo)；為膠質(zhì)瘤的診斷提供可靠的依據(jù)。以膠質(zhì)瘤中的VEGF、Sox-2及CXCR4為出發(fā)點(diǎn)，可為膠質(zhì)瘤的治療找到新方法。因此我們可以通過阻斷VEGF、CXCR4 在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，來抑制腦膠質(zhì)瘤的血管形成，從而使腫瘤細(xì)胞得不到營養(yǎng)供應(yīng)而凋亡；通過阻斷Sox-2的表達(dá)，來抑制腫瘤干細(xì)胞的活性，阻止其不斷增殖，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。