趙艷媛 顏黃蘋(píng) 陳延平 曾少軍 殷皓

組織工程技術(shù)主要采用細(xì)胞和生物材料共同構(gòu)建與正常組織結(jié)構(gòu)功能相近的復(fù)合物來(lái)修復(fù)缺損[1]。生物膜的組織工程化研究是當(dāng)前的熱點(diǎn)方向之一。組織工程化生物膜研究的主要是生物體各器官中的膜結(jié)構(gòu)，如組織工程化角膜、組織工程化黏膜、組織工程化滑膜等。

以往的組織工程化生物膜培養(yǎng)技術(shù)多為靜態(tài)培養(yǎng)，由人工操作，易導(dǎo)致構(gòu)建的組織工程化生物膜被污染。近年來(lái)，生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)技術(shù)的研究不斷深入。在組織工程化角膜研究方面，Tsai等[2]以羊膜為載體，進(jìn)行角膜上皮組織培養(yǎng)，患者移植后取得了較好的療效。Fan等[3]用貼膜培養(yǎng)法與時(shí)間梯度連續(xù)揭膜法，成功建立人生物膜內(nèi)皮細(xì)胞系。王丹等[4]用全生物膜組織培養(yǎng)法成功得到純度高、產(chǎn)量多的生物膜成纖維細(xì)胞。針對(duì)組織工程化黏膜的研究中，Rouabhia等[5]以口腔上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞成功構(gòu)建黏膜，其上皮層分層良好，固有層也有大量的成纖維細(xì)胞聚集。Fukahori等[6]利用組織工程化黏膜成功修復(fù)了比格犬的聲帶黏膜缺損。組織工程小腸黏膜下層已被應(yīng)用于血管、膀胱壁、腹壁、肌壁及神經(jīng)等多種組織的缺損修補(bǔ)[7]。在組織工程化滑膜的研究中，李穎杰等[8]構(gòu)建了能模擬滑膜襯里層的多層結(jié)構(gòu)細(xì)胞層。王麗平等[9]采用組織塊貼壁法成功分離培養(yǎng)了佐劑性關(guān)節(jié)炎兔成纖維樣滑膜細(xì)胞。孫貴才等[10]的研究證實(shí)，組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)，能培養(yǎng)出具有最強(qiáng)大活力的細(xì)胞。

這些動(dòng)態(tài)培養(yǎng)技術(shù)的培養(yǎng)條件難以控制，導(dǎo)致生物膜形態(tài)、質(zhì)量難以標(biāo)準(zhǔn)化，且固定條件下培養(yǎng)的生物膜無(wú)法滿足臨床個(gè)性化治療的需求。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的壓力與生物膜的培養(yǎng)具有密切聯(lián)系[11-15]。陸曉娜等[14]設(shè)計(jì)了可為軟骨組織提供循環(huán)可控動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激的組織工程培養(yǎng)儀；陶蒙設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的儀器可通過(guò)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)軸來(lái)改變力學(xué)環(huán)境，以實(shí)現(xiàn)角膜的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)[15]。但這些調(diào)整壓力的方式較為復(fù)雜，不易操作，且有污染培養(yǎng)基的可能。因此，我們嘗試設(shè)計(jì)一種組織工程化生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，通過(guò)控制培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的壓力，來(lái)為生物膜組織工程培養(yǎng)提供可控的動(dòng)態(tài)力學(xué)環(huán)境，以適合不同患者對(duì)生物膜的需求。

1 培養(yǎng)基壓力控制原理

研究表明，力學(xué)環(huán)境對(duì)于組織工程化生物膜的培養(yǎng)有重要影響，一定的力學(xué)刺激可促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移，有利于生物膜組織的修復(fù)[11-15]。

由帕斯卡定律可知，液體中任一點(diǎn)壓力為F=ρgV（式 1）[16]。 其中，F(xiàn) 為液體中任一點(diǎn)的壓力；ρ 為液體密度；g為重力常數(shù)；V為液體總體積。

在一圓柱形容器中，設(shè)兩處連通口，進(jìn)液口s0和出液口s1（圖1）。經(jīng)推算，該容器中任一點(diǎn)壓力為F=ρghs+ρgv0t(s0-s1)（式 2）。 其中，h 為容器高度；s為容器底面積；s0為容器進(jìn)液口截面積；s1為容器出液口截面積；v0為液體流速；t為單位時(shí)間。

圖1 容器結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of culture dish structure

由式（2）可知，容器內(nèi)任一點(diǎn)的壓力與進(jìn)液口截面積和出液口截面積之差成正比，控制進(jìn)液口截面積或出液口截面積即可改變其壓力值。因此，本文據(jù)此原理設(shè)計(jì)一種基于培養(yǎng)基壓力控制的組織工程化生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)。

2 基于培養(yǎng)基壓力控制的組織工程化生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)

我們提出的基于培養(yǎng)基壓力控制的組織工程化生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，主要由培養(yǎng)皿、蠕動(dòng)泵、壓力控制模塊、主控器與檢測(cè)模塊等組成（圖2）。組織工程化生物膜放置于培養(yǎng)皿內(nèi)，蠕動(dòng)泵啟動(dòng)后，培養(yǎng)基充滿培養(yǎng)皿并在培養(yǎng)過(guò)程中不斷循環(huán)；通過(guò)主控器設(shè)置生物膜組織培養(yǎng)的時(shí)間、培養(yǎng)基壓力值，然后系統(tǒng)開(kāi)始運(yùn)行，監(jiān)測(cè)模塊實(shí)時(shí)采集培養(yǎng)基的壓力值數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)傳輸至主控器，主控器根據(jù)壓力值數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷，命令壓力控制模塊相應(yīng)地調(diào)整培養(yǎng)基的壓力值；以上過(guò)程循環(huán)進(jìn)行，直至培養(yǎng)結(jié)束。

2.1 培養(yǎng)皿

培養(yǎng)皿作為生物膜組織細(xì)胞生長(zhǎng)增殖最直接的環(huán)境，培養(yǎng)基在此循環(huán)，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)。傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿為圓盤(pán)狀培養(yǎng)皿或瓶狀培養(yǎng)皿[17-18]，固定組織操作不便，培養(yǎng)基不能循環(huán)，無(wú)法檢測(cè)培養(yǎng)基壓力。因此，本研究設(shè)計(jì)了一種新型的培養(yǎng)皿 （圖3），是空心圓柱形器皿，為培養(yǎng)基存儲(chǔ)與循環(huán)的主要空間，在培養(yǎng)皿壁上開(kāi)3個(gè)通孔，分別作為進(jìn)液口、出液口及監(jiān)測(cè)口。生物膜組織放置于固定平臺(tái)，用帶有橡膠圈的卡扣式圓環(huán)固定，當(dāng)培養(yǎng)基充滿培養(yǎng)皿時(shí)便與之接觸，并隨培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基體積的變化鼓起或收縮。監(jiān)測(cè)模塊中的壓力傳感器通過(guò)監(jiān)測(cè)口接觸培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，監(jiān)測(cè)其壓力值。該培養(yǎng)皿密封性好，操作簡(jiǎn)單，可有效防止材料污染，便于觀察生物膜培養(yǎng)狀態(tài)及壓力檢測(cè)與控制。

2.2 蠕動(dòng)泵與壓力控制模塊

蠕動(dòng)泵為驅(qū)使培養(yǎng)基流動(dòng)與循環(huán)的裝置，培養(yǎng)基被隔離在泵管中，可快速更換泵管與消毒，避免發(fā)生污染，并可保持培養(yǎng)基流速。

我們利用壓力控制模塊，保持培養(yǎng)皿進(jìn)液口截面積s0不變，通過(guò)改變出液口截面積s1以控制培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基壓力。其中，液體密度ρ與重力加速度g為常數(shù)。培養(yǎng)基壓力控制模塊位于培養(yǎng)皿出液口處，用于控制培養(yǎng)基壓力。該壓力控制模塊中使用步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)兩擋板擠壓出液口連接軟管，改變軟管的截面積，即出液口截面積，從而控制培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基的壓力；而電機(jī)的動(dòng)作由主控器發(fā)送至電機(jī)驅(qū)動(dòng)器的命令決定。

2.3 主控器與監(jiān)測(cè)模塊

生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)主控器為STM32F103單片機(jī)，外接觸摸屏作為用戶操作界面。監(jiān)測(cè)模塊使用SM5852－008壓力傳感器，經(jīng)培養(yǎng)皿檢測(cè)口與培養(yǎng)基接觸獲得壓力值?？稍诓僮鹘缑嬖O(shè)置生物膜組織培養(yǎng)的時(shí)間與培養(yǎng)基壓力值，控制器根據(jù)監(jiān)測(cè)模塊傳來(lái)的數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷，發(fā)送指令至壓力控制模塊，壓力控制模塊執(zhí)行相應(yīng)的操作，以保證生物膜的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。

該培養(yǎng)系統(tǒng)軟件部分的主流程為初始化、設(shè)置、運(yùn)行、結(jié)束4個(gè)步驟。系統(tǒng)初始化后，可設(shè)置生物膜組織培養(yǎng)的時(shí)間、培養(yǎng)基壓力值，系統(tǒng)開(kāi)始運(yùn)行（圖4），結(jié)合（式3）算法使系統(tǒng)自動(dòng)運(yùn)行直至結(jié)束。

圖4 系統(tǒng)運(yùn)行程序流程圖Fig.4 Flow chart of system running program

3 實(shí)驗(yàn)與測(cè)試

運(yùn)行該基于培養(yǎng)基壓力控制的組織工程化生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，主控器驅(qū)動(dòng)壓力控制模塊逐步改變出液口截面積，檢測(cè)模塊讀取相應(yīng)的培養(yǎng)基壓力值，可獲得出液口截面積與培養(yǎng)基壓力值的關(guān)系曲線（圖 5）。

重復(fù)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行曲線擬合后可得出液口截面積與培養(yǎng)基壓力值S曲線擬合曲線（圖5），其關(guān)系式即（式 3）。

圖5 實(shí)測(cè)出液口截面積與培養(yǎng)基壓力值關(guān)系曲線及其S曲線擬合曲線Fig.5 Relation curve between the output area and the pressure value.Solid line for measured curve and dashed line for S curve fitting curve

在該系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中，主控器根據(jù)設(shè)定的壓力值通過(guò)（式3）算法可迅速將壓力值調(diào)整至設(shè)定值附近，再通過(guò)運(yùn)行程序流程圖細(xì)調(diào)便可使培養(yǎng)基壓力值達(dá)到設(shè)定值。

結(jié)果顯示，本研究提出的基于培養(yǎng)基壓力控制的組織工程化生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，可控制培養(yǎng)基壓力范圍為0.12～19.76 mmHg，并可使其保持在某一固定值。一般地，正常眼壓為 10～21 mmHg[19]，正常顱內(nèi)壓為7～11 mmHg[20]，該系統(tǒng)可滿足在此壓力環(huán)境內(nèi)生物膜的培養(yǎng)要求。

4 結(jié)論

本研究提出的基于培養(yǎng)基壓力控制的組織工程化生物膜動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，包括培養(yǎng)皿、蠕動(dòng)泵、壓力控制模塊、主控器與檢測(cè)模塊等部分，可實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基壓力在0.12～19.76 mmHg范圍內(nèi)的控制，可提供此壓力范圍內(nèi)生物膜培養(yǎng)所需的壓力環(huán)境。與傳統(tǒng)的生物膜培養(yǎng)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)使培養(yǎng)更具可控性，標(biāo)準(zhǔn)化，使培養(yǎng)的生物膜可適應(yīng)不同患者的需求，有利于進(jìn)一步的臨床治療與研究。對(duì)于該系統(tǒng)的研究，下一步應(yīng)投入實(shí)際的生物膜培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究生物膜的培養(yǎng)狀況，進(jìn)一步完善該系統(tǒng)。