夏肖雪 ，呂正梅，張守兵

毛囊干細胞在燒傷、燙傷和脫發(fā)等的臨床治療方面有很好的應用前景[1]。目前，其體外培養(yǎng)體系均需添加胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，以維持干細胞的生長[2]。但是，血清的具體成分極其復雜，將含FBS的培養(yǎng)基用于以臨床治療為目的的毛囊干細胞培養(yǎng)，很可能帶來許多不可控的風險和問題，如病毒等微生物污染、FBS的批次差異及倫理學問題等[3]。因此，建立一種不含血清、化學成分確定的毛囊干細胞體外培養(yǎng)體系就成為了必需。

課題組在之前的研究中成功建立了大鼠毛囊干細胞的培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)體系甚至能夠從一根大鼠觸須毛囊中獲取大量毛囊干細胞并重建功能性皮膚[4-6]。但是，該培養(yǎng)體系仍然是含FBS的。因此，該實驗嘗試在此基礎上用KnockOutTM血清替代物 (KnockOutTMserum replacement, KSR)代替FBS，建立毛囊干細胞無血清培養(yǎng)體系并重建有毛皮膚，為毛囊干細胞的臨床研究和應用提供前期資料和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物及細胞來源 7周齡成年雌性裸鼠(nu/nu)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，置于安徽省實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)室常規(guī)飼養(yǎng)1周后待用；新生SD大鼠由安徽省實驗動物中心提供。大鼠毛囊干細胞及綠色熒光蛋白標記的毛囊干細胞(green fluorescence-expressing hair follicle stem cell, GFP-HFSC)[4]由中國科學院動物研究所段恩奎研究組贈送，本實驗室傳代保存。

1.1.2主要試劑 澳洲胎牛血清購自香港MRC公司；William’E生長培養(yǎng)基、KSR、Ⅳ型膠原酶、Dispase酶和胰酶消化液購自美國Invitrogen公司；Matrigel基質膠(Corning Matrigel Basement Membrane Matrix) 購自美國BD biosciences公司；硅膠貼(Epi-Derm? Silicone Gel Sheeting)購自美國Biodermis公司；兔抗大鼠P63單克隆抗體購自英國abcam公司；小鼠抗大鼠α6-整合素抗體購自英國Serotec公司；兔抗大鼠角蛋白K14單克隆抗體、FITC標記山羊抗小鼠IgG二抗及FITC標記山羊抗兔IgG二抗均購自北京中杉金橋公司；其余試劑均為國產，分析純級。

1.2方法

1.2.1無血清培養(yǎng)體系的構建 將第5代大鼠毛囊干細胞復蘇，進行分組培養(yǎng)。一組繼續(xù)用含血清培養(yǎng)基(添加15%胎牛血清的生長培養(yǎng)基)培養(yǎng)，標記為FBS組；另一組將胎牛血清逐漸替換為KSR，標記為KSR組，血清濃度按每天5%的梯度從15%遞減至0，同時KSR的濃度按5%的梯度從0遞增至15%，維持生長培養(yǎng)基中FBS和KSR的總濃度在15%，直至生長培養(yǎng)基含15%的KSR。KSR組用無血清培養(yǎng)基(含15%KSR的生長培養(yǎng)基)傳代培養(yǎng)至第10代，FBS組同步培養(yǎng)至第10代。倒置顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)條件下兩組毛囊干細胞的生長狀態(tài)。GFP-HFSC分別用無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基從第7代培養(yǎng)至第12代。

1.2.2毛囊干細胞在兩種培養(yǎng)條件下的生長曲線比較 各取1×104個用無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的第10代毛囊干細胞，接種到100 mm培養(yǎng)皿并分別用無血清培養(yǎng)基(KSR組)和含血清培養(yǎng)基(FBS組)同步培養(yǎng)，分別在第2、4、6、8、10、12天收集細胞并計數，每個時間點做3次重復，取細胞數平均值，繪制生長曲線。

1.2.3毛囊重建 毛囊重建實驗根據課題組已建立的方法完成[5]。簡而言之，用酶(0.25%的胰酶和6.25 mg/ml的Dispase酶體積比3 ∶2)消化法將新生大鼠背部皮膚的表皮和真皮分離，用3 mg/ml的Ⅳ型膠原酶將真皮消化為單細胞懸液，收集真皮細胞備用。

為方便移植后追蹤毛囊干細胞的去向，使用GFP-HFSC進行移植。將GFP-HFSC與收集的真皮細胞以1 ∶5的比例混合，即3.5×106個毛囊干細胞和1.8×107個真皮細胞混合，用于一只裸鼠的移植；用William’E生長培養(yǎng)基將混合細胞重懸，與Matrigel基質膠混勻，置于硅膠貼上，制成直徑為1.5 cm的細胞凝膠，用于移植；實驗組(KSR組)中的毛囊干細胞為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的第12代GFP-HFSC，陽性對照組(FBS組)中的毛囊干細胞為含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的第12代GFP-HFSC，陰性對照組不含毛囊干細胞，僅含真皮細胞。

15只裸鼠分為3批，每批5只，含實驗組2只、陽性對照組1只和陰性對照組2只，每隔1天手術一批。裸鼠麻醉后，手術去除其背部局部全層皮膚，大小與細胞凝膠一致；將硅膠貼覆蓋在傷口上，小心使黏附其上的細胞凝膠填充于傷口內，用醫(yī)用紗布和繃帶固定包扎；術后4周頸椎脫臼法處死裸鼠，取背部新生皮膚，冰凍切片，厚度10 μm，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4免疫熒光檢測毛囊干細胞中高表達的蛋白 分別將含血清培養(yǎng)基及無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的第10代毛囊干細胞黏附到蓋玻片上；4%多聚甲醛固定，5%BSA封閉后，分別加入小鼠抗大鼠α6-整合素抗體(1 ∶200)、兔抗大鼠角蛋白K14抗體(1 ∶200)及兔抗大鼠P63抗體(1 ∶300)，于4 ℃孵育過夜；次日分別加入FITC標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(1 ∶100)，37 ℃孵育1 h；室溫條件下，用PI染核10 min，DABCO封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1毛囊干細胞無血清培養(yǎng)體系的建立為嘗試建立毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)體系，用KSR逐漸替換培養(yǎng)基中的FBS，結果顯示，毛囊干細胞可以正常生長并最終長滿整個培養(yǎng)皿。使用無血清培養(yǎng)基進行常規(guī)傳代，結果顯示該干細胞可以產生新的克隆，并且FBS組和KSR組毛囊干細胞之間在形態(tài)上未發(fā)現明顯差異(圖1)。此外，用KSR替代FBS進行凍存液的配制，顯示KSR組毛囊干細胞在凍存后可以正常傳代并繼續(xù)生長。

圖1 兩種培養(yǎng)條件下毛囊干細胞形態(tài)的比較 ×200

A: 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的第10代大鼠毛囊干細胞(KSR組)；B: 含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的第10代大鼠毛囊干細胞(FBS組)

2.2不同培養(yǎng)基對毛囊干細胞生長的影響為檢測無血清培養(yǎng)基中毛囊干細胞的生長情況，用含血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基分別接種相同數量的毛囊干細胞(分別為FBS組和KSR組)進行同步培養(yǎng)，在不同時間點收集細胞，計數并繪制生長曲線。計數結果表明，KSR組毛囊干細胞在接種初期即細胞數目較少時生長速度較為緩慢，但隨著細胞生長細胞數目逐漸增加，其生長速度也在加快，最后與FBS組細胞數目相接近。總的來看，兩組毛囊干細胞生長曲線的趨勢基本一致(圖2)。

圖2 毛囊干細胞在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線

2.3毛囊重建為證明該無血清培養(yǎng)基能夠在體外維持毛囊干細胞的“干性”，將KSR組毛囊干細胞與真皮細胞混合，移植到裸鼠背部，檢測其重建毛囊的能力。為便于追蹤毛囊干細胞的去向，使用表達綠色熒光蛋白的毛囊干細胞GFP-HFSC進行移植(圖3A)。結果顯示，FBS陽性對照組(圖3B)與KSR實驗組(圖3C、3D)裸鼠背部均形成了新的皮膚，并且皮膚中均含有綠色熒光蛋白標記的毛囊及表皮，表明KSR組的GFP-HFSC重建了新的毛囊和表皮；而在陰性對照組的切片未發(fā)現毛囊，且表皮部分也未觀察到綠色熒光(圖3E)。

圖3 毛囊重建實驗

A：毛囊重建簡要流程 ×200；B：陽性對照(FBS組)形成新的含毛囊皮膚 ×400；C、D：KSR實驗組形成新的含毛囊皮膚 ×400；E：陰性對照組未形成新的毛囊 ×200；Der:真皮(dermis)；Epi:表皮 (epidermis)；HF:毛囊(hair follicle)；HS:毛干(hair shaft)；★:氣泡

2.4免疫熒光檢測毛囊干細胞高表達膜蛋白α6-整合素、角蛋白K14和核蛋白P63[4]。為驗證上述蛋白在KSR組毛囊干細胞中仍然表達，用免疫熒光染色方法進行檢測，結果顯示在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛囊干細胞仍然表達α6-整合素、角蛋白K14和P63(圖4)，表明該無血清培養(yǎng)基不會改變毛囊干細胞的性質。

圖4 大鼠毛囊干細胞的高表達蛋白免疫熒光染色

A：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛囊干細胞(KSR組)；B：含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛囊干細胞(FBS組)；α6-整合素、K14：×200 ; P63：×400

3 討論

皮膚具有阻止微生物入侵、防止脫水、調節(jié)體溫和感覺等重要功能[7]。毛囊是重要的皮膚附屬器，位于其隆突部的毛囊干細胞具有很強的增殖能力[8]，體外培養(yǎng)的毛囊干細胞在大面積燒傷、燙傷和禿頂的治療方面有良好的應用前景[9-10]。

然而，為了維持體外培養(yǎng)的毛囊干細胞的“干性”，目前的培養(yǎng)體系均含有胎牛血清。這種培養(yǎng)體系很可能會導致動物源性疾病的傳播如牛海綿狀腦炎等，甚至其他致病源的感染[11]。因此，毛囊干細胞在用于臨床研究和應用之前，必須建立一種不含血清的培養(yǎng)體系。KSR是一種化學成分確定的培養(yǎng)基添加試劑，已被證實可代替血清，用于未分化胚胎干細胞的生長和維持[12]。雖然之前有研究嘗試用KSR建立毛囊干細胞的無血清培養(yǎng)基，但由于培養(yǎng)條件的限制，毛囊干細胞的增殖能力呈下降趨勢，因此其干細胞特性很可能發(fā)生了改變[13]。

本實驗在先前建立的含胎牛血清的毛囊干細胞培養(yǎng)體系基礎上，用KSR代替胎牛血清，初步嘗試建立毛囊干細胞的無血清穩(wěn)定培養(yǎng)體系。從結果來看，分別用添加KSR和胎牛血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，毛囊干細胞的形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化，結果表明以KSR代替胎牛血清用于毛囊干細胞培養(yǎng)是可行的，沒有導致毛囊干細胞明顯分化或死亡等情況發(fā)生；從生長曲線來看，毛囊干細胞在無血清培養(yǎng)基中的增殖速率比在含胎牛血清培養(yǎng)基中稍慢，表明在不同培養(yǎng)體系中，毛囊干細胞的增殖存在差異，這主要體現在細胞數量較少時，無血清培養(yǎng)基中的毛囊干細胞增殖稍慢。然而，從增殖的總趨勢來看，兩者是基本一致的。此外，在細胞凍存的過程中也可用KSR代替胎牛血清，這就使得從毛囊干細胞的培養(yǎng)到凍存，均可以避免胎牛血清的使用。

判斷是否為毛囊干細胞最直接、最有力的證據就是檢驗其重建毛囊的能力[14]。該無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛囊干細胞移植到裸鼠背部，4周后重建了有毛囊皮膚，證明該培養(yǎng)基能夠在體外維持毛囊干細胞的“干性”。此外，免疫熒光染色結果表明，在表皮系干細胞中高表達的K14、α6-整合素和P63在該無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛囊干細胞中仍然表達。

綜上所述，本研究初步建立了含KSR的毛囊干細胞無血清培養(yǎng)體系，該體系能維持毛囊干細胞特性，能夠重建含毛囊皮膚。本研究為毛囊干細胞的臨床研究和應用提供了理論基礎和技術支持。