汪 波，劉艷艷，李家斌,2

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染依然是一項(xiàng)嚴(yán)峻的全球性公共衛(wèi)生問題，每年因HBV感染相關(guān)性肝病死亡人數(shù)多達(dá)百萬[1]。當(dāng)前，核苷酸類似物(nucleoside analogues，NAs)和聚乙二醇干擾素(pegylated interferon alfa，Peg-IFNα)是治療慢性乙型肝炎(chronic Hepatitis B，CHB)的兩類主要藥物，但兩者在臨床應(yīng)用上均存在一定局限性。NAs直接抑制病毒復(fù)制，降低病毒載量，但對cccDNA作用甚微，可能需要終身服藥[2]。Peg-IFNα通過促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞裂解感染肝細(xì)胞，并促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放控制病毒復(fù)制，具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的雙重功效，但有限療程(48周)，僅25%～30%的患者可獲得持久的治療應(yīng)答[3]。有研究[4-5]報(bào)道，HBV前C區(qū)(PC)區(qū)(G1896A)和基本核心啟動(dòng)子區(qū)(BCP)區(qū)(A1762T/G1764A)突變可終止或抑制HBeAg的合成，存在此變異的患者在Peg-IFNα治療結(jié)束后，容易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)變?yōu)镠BeAg陰性CHB患者。盡管當(dāng)前指南對Peg-IFNα聯(lián)合NAs治療CHB持謹(jǐn)慎態(tài)度，但是對于存在PC/BCP區(qū)相關(guān)變異患者能否受益于聯(lián)合治療至今鮮有報(bào)道。因此，該研究通過分析Peg-IFNα-2b單藥或聯(lián)合阿德福韋(adefovir，ADV)治療PC/BCP區(qū)相關(guān)突變的HBeAg陽性CHB患者的療效情況，為當(dāng)前CHB患者個(gè)體化治療提供新的依據(jù)及指導(dǎo)方向。

1 材料與方法

1.1病例資料選擇2012年6月～2014年7月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科收治的乙肝e抗原(HBeAg)陽性初治CHB患者，共89例。入選標(biāo)準(zhǔn)按照《慢性乙型肝炎防治指南》[6]：① 乙肝表面抗原(HBsAg)和HBeAg兩項(xiàng)均陽性并且>6個(gè)月。② 乙肝病毒(HBV) DNA ≥20 000 IU/ml；2×正常值上限(upper limits of the normal，ULN)≤谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)≤10×ULN;③ 血清總膽紅素<2×ULN; ④ 排除其他病毒感染、精神病史、自身免疫疾病、失代償肝硬化等。本試驗(yàn)獲得安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組 89例CHB初治患者隨機(jī)接受單藥治療(單用Peg-IFNα-2b)或聯(lián)合治療(Peg-IFNα-2b+ ADV)。單藥組給予Peg-IFNα-2b (愛爾蘭先靈葆雅公司) 1.5 μg/kg，1次/周(皮下注射)；聯(lián)合組給予Peg-IFNα-2b 1.5 μg/kg，1次/周(皮下注射)，并口服ADV(10 mg/d)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室檢測 89例患者基線時(shí)血清標(biāo)本均提取HBV DNA模版、PCR擴(kuò)增和測序分析突變情況；對于測序失敗的20例樣本進(jìn)行PCR產(chǎn)物TA克隆，每個(gè)樣本挑取16個(gè)克隆測序分析突變有無，TA克隆與測序部分由深圳華大基因公司(BGI)完成。HBV DNA定量采用Roche Cobas TaqMan48(美國Roche公司)，檢查下限為20 IU/ml，檢測上限為1.70E+8 IU/ml。HBsAg、HBeAg和HbeAb檢測均采用Roche Diagnostics(美國Roche公司)，HBsAg檢查下限為0.05 IU/ml，HBeAg<1 COI為陰性，>1 COI為陽性；HBeAb<1 COI為陽性，>1 COI為陰性。HBV基因型送檢上海之江生物有限公司。

1.2.3治療應(yīng)答及突變的定義 前12周每位患者每4周隨訪1次，12周之后每位患者每12周隨訪1次，直至72周結(jié)束。HBeAg血清轉(zhuǎn)換：出現(xiàn)HBeAg陰性(<1 COI)、HbeAb陽性(<1 COI)。聯(lián)合應(yīng)答：HBeAg血清轉(zhuǎn)換，并且HBV DNA<2 000 IU/ml，并伴有ALT低于正常值上限。關(guān)于突變:PC為只存在PC區(qū)G1896A位點(diǎn)突變，BCP為只存在BCP區(qū)A1762T/G1764A位點(diǎn)的雙突變，Both為PC和BCP兩種突變均存在，見表1。

2 結(jié)果

2.1患者基線特征89例CHB初治患者中，73例(82%)為PC/BCP區(qū)突變(非野生型，Non-WT)患者，16例(18%)為野生型(WT)患者。Non-WT中33例患者接受單藥治療(單用Peg-IFNα-2b)，40例患者接受聯(lián)合治療(Peg-IFNα-2b+ADV)。WT中11例患者接受單藥治療，5例患者接受聯(lián)合治療。WT和Non-WT患者中的單藥組和聯(lián)合組分別在年齡、性別、ALT、HBV DNA、HBeAg、HBsAg、基因型構(gòu)成比、PC/BCP突變構(gòu)成比方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2隨訪結(jié)束時(shí)應(yīng)答情況Non-WT患者(n=73)中，單藥組與聯(lián)合組患者在48周HBeAg血清轉(zhuǎn)換率、聯(lián)合應(yīng)答率上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；72周隨訪結(jié)束時(shí)，兩組患者在HBeAg血清轉(zhuǎn)換率上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.519)，但在聯(lián)合應(yīng)答率上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)，見表2；單藥組48周獲得聯(lián)合應(yīng)答的患者3例在72周時(shí)全部復(fù)發(fā)(HBV DNA>2 000 IU/ml)；聯(lián)合組48周聯(lián)合應(yīng)答的患者8例在72周保持聯(lián)合應(yīng)答仍有6例(75%)。聯(lián)合組72周時(shí)出現(xiàn)HBsAg清除患者2例(5 %)，而單藥組未發(fā)現(xiàn)HBsAg清除患者。對于WT患者(n=16)，不管在48周或72周時(shí)，單藥組和聯(lián)合組的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率和聯(lián)合應(yīng)答率上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3Non-WT患者中單藥組和聯(lián)合組治療結(jié)束和隨訪結(jié)束時(shí)ALT、HBVDNA、HBsAg和HBeAg水平的比較治療結(jié)束時(shí)，聯(lián)合組ALT、HBV DNA 和HBeAg均值水平均低于單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但是隨訪結(jié)束時(shí)，聯(lián)合組較單藥組在ALT、HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

HBV雖然是一種DNA病毒，但是它的復(fù)制卻經(jīng)過RNA中間產(chǎn)物介導(dǎo)，由于DNA聚合酶缺乏校正功能和病毒高復(fù)制率雙重因素，HBV在復(fù)制過程中容易產(chǎn)生突變[7]。文獻(xiàn)[4-5,8]報(bào)道，HBV PC/BCP區(qū)相關(guān)變異可以對Peg-IFNα的療效產(chǎn)生影響，其中以G1896A和A1762T/G1764A突變位點(diǎn)最為重要。存在相應(yīng)突變的HBeAg陽性CHB患者雖然在治療結(jié)束后可以獲得較高的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率，但是多數(shù)患者隨訪后會發(fā)生病毒學(xué)的反彈，最終可能發(fā)展為HBeAg陰性CHB患者[5]。這對CHB患者的個(gè)體化治療提出了挑戰(zhàn)。

表1 患者基線特征

表2 Non-WT和WT患者48周和72周治療應(yīng)答情況[n(%)]

表3 Non-WT患者中單藥組與聯(lián)合組血清標(biāo)志物比較

改變治療策略，最大限度地提高CHB患者治療結(jié)束后的持續(xù)應(yīng)答率是當(dāng)前國內(nèi)外眾多專家共識。本研究隨訪結(jié)束時(shí)聯(lián)合治療組和單藥組均獲得了較高的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率(37%vs30%)，但在聯(lián)合應(yīng)答率上聯(lián)合治療組明顯高于單藥組(35%vs12%)。這說明PC/BCP區(qū)突變的HBeAg陽性CHB患者不管是單藥治療還是聯(lián)合治療均較易出現(xiàn)HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，但聯(lián)合治療可以明顯降低隨訪后的病毒學(xué)反彈率。其中的機(jī)制可能與ADV降低病毒載量，增強(qiáng)機(jī)體對Peg-IFNα-2b應(yīng)答存在一定關(guān)系[9]。在機(jī)體免疫清除HBV過程中需要固有免疫和適應(yīng)性免疫的協(xié)調(diào)配合，而研究[10]表明HBV具有潛在抑制固有免疫能力，并且高水平的HBsAg和HBeAg與T細(xì)胞的耗竭存在關(guān)系。Peg-IFNa-2b可以通過促進(jìn)CD56bright(高表達(dá)CD56)NK細(xì)胞的增殖及IL-15的表達(dá)，上調(diào)TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和IFN-γ，引起感染肝細(xì)胞的凋亡從而降低病毒載量及HBsAg水平[11]。但是Peg-IFNa-2b對CD8+T細(xì)胞的作用與NK細(xì)胞存在存在差異，研究[12]報(bào)道在Peg-IFNa-2b治療過程中可以導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的耗竭，此外HBV-特異性CD8+T細(xì)胞始終處于低頻狀態(tài)，未能觀察到其功能的恢復(fù)。相反，核苷類似物治療過程中可以觀察到CD8+T細(xì)胞的恢復(fù)，但未見對NK細(xì)胞功能有恢復(fù)作用[12]，其中的作用機(jī)制仍未完全清除，可能與直接抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)CD4+Th1細(xì)胞分化進(jìn)而促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的分化激活有關(guān)。存在PC/BCP突變的CHB患者在Peg-IFNα-2b治療過程中，HBV DNA載量降低較慢常保持高水平，這可能限制了CD8+T細(xì)胞恢復(fù)，從而限制了機(jī)體免疫對Peg-IFNa-2b的療效；而在治療過程中聯(lián)合ADV可明顯降低病毒載量，從而幫助恢復(fù)CD8+T功能。正是兩者不同而又互補(bǔ)的免疫修復(fù)機(jī)制，為聯(lián)合治療控制HBV感染提供了依據(jù)。本研究突變組中2例(5%)HBsAg清除患者均接受聯(lián)合治療，作為抗病毒治療的理想終點(diǎn)，Peg-IFNα-2b聯(lián)合ADV對存在PC/BCP區(qū)突變的HBeAg陽性CHB患者的HBsAg清除率依然較低，與以往的干擾素單藥治療類似。

Peg-IFNα-2b聯(lián)合ADV可以提高聯(lián)合應(yīng)答率，相關(guān)結(jié)論是否可以推廣到Peg-IFNα聯(lián)合拉米夫定、恩替卡韋或替諾福韋仍不清楚，這有待進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。關(guān)于Peg-IFNα聯(lián)合NAs的時(shí)機(jī)，各國學(xué)者對CHB患者也進(jìn)行了諸多探索：序貫治療(先接受Peg-IFNα或NAs一段時(shí)間治療，再轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N藥物)、添加治療(Peg-IFNα或NAs治療過程中添加另一種藥物)或本試驗(yàn)的雙重治療(Peg-IFNα與NAs同時(shí)聯(lián)合)。是否每種治療策略對PC/BCP區(qū)突變的HBeAg陽性CHB患者療效均相同，仍有待更大的前瞻性多中心研究。

綜上所述，本研究顯示Peg-IFNα-2b聯(lián)合ADV，可明顯提高PC/BCP區(qū)突變的HBeAg陽性CHB患者隨訪后聯(lián)合應(yīng)答率。對于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測存在PC/BCP區(qū)突變的CHB患者，建議在常規(guī)Peg-IFNα-2b治療方案上增加ADV進(jìn)行治療。