陳先俠，王海霞，盧曉倩，蔣曉敏，李 兵，呂紅梅

胎盤植入(placenta accreta)是一種較為嚴重的妊娠并發(fā)癥，指胎盤的絨毛滋養(yǎng)層細胞不同程度的侵入子宮肌層。近年來，隨著孕婦剖宮產(chǎn)次數(shù)和人工流產(chǎn)次數(shù)的增加，胎盤植入的發(fā)病率顯著增高[1]。胎盤植入可引起嚴重不良妊娠結(jié)局，危及孕產(chǎn)婦和胎兒的生命。目前，子宮因素(子宮蛻膜、肌間血管重塑障礙)和滋養(yǎng)細胞侵襲能力增強是影響胎盤植入發(fā)病的主要因素[2]。在某些生理和病理情況下，上皮細胞可以向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial- mesenchymal transition，EMT)，是腫瘤形成、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移和惡性發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。轉(zhuǎn)錄因子Twist和Snail基因最先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，與胚胎生長發(fā)育中細胞遷移調(diào)控相關(guān)，是EMT最基本的轉(zhuǎn)錄因子，具有癌基因的特征，在惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，早期參與調(diào)控EMT，影響腫瘤細胞的遷移和侵襲[4]。Twist和Snail基因參與EMT調(diào)控，對胚胎發(fā)育和腫瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要調(diào)控作用，而胎盤植入發(fā)病中，滋養(yǎng)細胞向子宮內(nèi)膜的侵襲類似于腫瘤細胞具有的遷移和侵襲特點，同時，在EMT中，波形蛋白(Vimentin)是最為重要的一種基質(zhì)形成的彈性蛋白[5]。該研究通過檢測Twist、Snail在正常胎盤和絨毛植入胎盤組織中的表達，探討Twist、Snail與滋養(yǎng)細胞侵襲性的關(guān)系，以及EMT在胎盤植入中聯(lián)系，旨在進一步認識胎盤植入發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1病例資料178例胎盤組織為2013年1月～2017年12月在醫(yī)院定期產(chǎn)前檢查和分娩的孕產(chǎn)婦，其中正常對照者42例(對照組)，136例胎盤植入孕產(chǎn)婦(胎盤植入組)分娩后均經(jīng)兩名病理科醫(yī)師獨立閱片確診，參照文獻[6]中華醫(yī)學會《胎盤植入診治指南(2015)》的植入程度分組：分輕度組(47例)，即胎盤粘連，胎盤絨毛植入侵及子宮肌層；中度組(45例)，胎盤絨毛植入深層≥子宮肌層1/2，但未侵及子宮漿膜層；重度組(44例)，即穿透性胎盤植入，胎盤絨毛植入穿透至子宮漿膜層，可侵及子宮外膀胱或直腸等鄰近組織。兩組一般情況見表1。與對照組比較，胎盤植入組孕產(chǎn)婦的年齡增大，妊娠次數(shù)和流產(chǎn)次數(shù)增多，分娩孕周較小(P<0.05，P<0.01)。納入該項研究的孕產(chǎn)婦均排除圍產(chǎn)期心肌病、妊娠期高血壓、糖尿病和胎膜早破等病史。對照組和胎盤植入組孕產(chǎn)婦對本次研究胎盤標本收集處理均知情，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本和試劑 胎盤娩出后，迅速取胎盤母體面的胎盤組織2塊(約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)，取材時，正常組選取母體面胎盤中間帶部位，胎盤植入組選取粘連或植入部位，注意避開出血、壞死、鈣化處。用于Western blot檢測的一塊組織迅速置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫涣硪粔K標本常規(guī)處理制備石蠟切片，進行免疫組織化學檢測，標本固定于10%福爾馬林溶液。主要試劑包括：兔抗人Vimentin多克隆抗體、羊抗人Twist多克隆抗體、羊抗人Snail多克隆抗體、羊抗人β-actin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；即用型SP免疫組化和二氨基聯(lián)苯(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

表1 兩組孕產(chǎn)婦的一般臨床資料比較

1.2.2免疫組化檢測Twist、Snail蛋白表達和結(jié)果數(shù)量判定 采用免疫組織化學SP法檢測蛋白表達，操作步驟嚴格按照使用說明書進行。胎盤組織常規(guī)脫水、石蠟包埋，厚4 μm 連續(xù)切片，烤片、脫蠟、微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加一抗(Twist，抗體稀釋度為1 ∶100；snail，抗體稀釋度為1 ∶150)50 μl，4 ℃孵育過夜，沖洗后滴加生物素標記的二抗(1 ∶200 稀釋)50 μl，滴加DAB工作液顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。以PBS 代替一抗為陰性對照。利用Nikon 4500顯微鏡攝片，Twist、Snail表達陽性結(jié)果為細胞質(zhì)或胞核染成棕黃色，每張切片隨機選取5個×200倍視野，計數(shù)陽性染色細胞數(shù)。

1.2.3Western blot分析Twist、Snail蛋白表達 取出低溫保存的胎盤組織，在玻璃勻漿器中，加入1%體積分數(shù)的RIPA裂解液進行勻漿，冰水中超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清提取蛋白，應(yīng)用BCA法進行蛋白質(zhì)定量，蛋白樣品煮沸變性，SDS - PAGE電泳，分別加入羊抗人Twist 、Snail一抗(均為1 ∶1 500稀釋)，蛋白質(zhì)濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，生物素化兔抗羊二抗(1 ∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL化學發(fā)光法顯色，Image J凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像，測定目標條帶的光密度值，以β-actin為內(nèi)參，比較同一胎盤組織目標條帶與β-actin的光密度值，進行半定量分析。

1.2.4EMT檢測和相關(guān)性分析 采用免疫組化染色SP法顯示胎盤組織中Vimentin蛋白表達，并與轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail蛋白表達結(jié)果進行相關(guān)性分析。免疫組化染色方法和結(jié)果判斷與1.2.2步驟相同。組織為前述兩種轉(zhuǎn)錄因子連續(xù)切片的鄰片，觀察并分析各組免疫組化染色切片結(jié)果圖像。

2 結(jié)果

2.1胎盤組織中Twist、Snail蛋白的表達情況免疫組化SP染色結(jié)果顯示，Twist、Snail 陽性染色結(jié)果顯示胎盤的絨毛細胞或平滑肌細胞等細胞質(zhì)或細胞核有棕黃色顆粒沉著，對照組胎盤組織中Twist(圖1A)、Snail(圖2A)表達較弱，胎盤植入組織中Twist、Snail表達明顯增強，且隨著胎盤植入程度的加重，即Twist、Snail表達由胎盤粘連的輕度組(圖1B、2B)到胎盤植入的中度組(圖1C、2C)，再到穿透性胎盤植入重度組(圖1D、2D)呈逐漸增強趨勢。采取南京大學捷達80i軟件計數(shù)陽性細胞數(shù)，結(jié)果見圖3，與對照組陽性染色細胞數(shù)比較，胎盤植入組陽性細胞數(shù)顯著增多，且隨著胎盤植入程度的加重，增多趨勢有顯著性(P<0.05，P<0.01)。

圖1 胎盤母體面組織中Twist蛋白表達 ×200

2.2Westernblot法檢測Twist、Snail蛋白表達Western blot法檢測各組胎盤組織中Twist、Snail蛋白，與對照組胎盤組織比較，隨著絨毛植入程度的增加，即由輕度胎盤粘連到中度胎盤植入，再到穿透性胎盤植入，胎盤組織中Twist、Snail蛋白灰度呈升高趨勢。灰度比值Image J軟件半定量分析顯示，胎盤植入組胎盤組織中Twist /β-actin、Snail /β-actin顯著高于對照組胎盤組織中Twist /β-actin、Snail /β-actin。見圖4。

圖2 胎盤母體面組織中Snail蛋白表達 ×200

圖3 胎盤母體面組織中Twist、Snail蛋白陽性細胞表達情況

2.3胎盤組織中Vimentin蛋白表達及其與Twist、Snail蛋白表達的相關(guān)性免疫組化SP染色結(jié)果顯示，Vimentin蛋白陽性染色結(jié)果顯示胎盤細胞間質(zhì)中有棕黃色物質(zhì)沉著，對照組表達較弱(圖5)，胎盤植入組136例中，102例Twist表達陽性，其中91例Vimentin陽性表達，與Twist蛋白呈正相關(guān)性(r=0.180，χ2=7.682，P=0.006)。Snail蛋白Vimentin蛋白表達隨著胎盤植入程度的加重呈逐漸增強趨勢，97例Snail蛋白表達陽性中，有82例Vimentin陽性表達，與Snail蛋白呈正相關(guān)性(r=0.154，χ2=5.551，P=0.018)。

圖4 Western blot檢測胎盤組織中Twist、Snail蛋白表達

圖5 胎盤母體面組織中Vimentin蛋白陽性表達 ×200

3 討論

高血壓和產(chǎn)科性出血是孕產(chǎn)婦最為嚴重的不良妊娠，導(dǎo)致嚴重產(chǎn)科性出血的主要因素是胎盤植入[1]。研究[7]顯示，孕產(chǎn)婦胎盤植入是發(fā)生嚴重不良妊娠結(jié)局的獨立危險因素。胎盤植入是指部分或全部絨毛侵及子宮肌層，根據(jù)植入的不同程度，可分為胎盤粘連、胎盤植入和穿透性胎盤植入3種類型；妊娠期間，滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移進入絨毛間質(zhì)中，類似于腫瘤細胞的侵襲性。本組研究和以往研究類似，與正常孕產(chǎn)婦比較，胎盤植入組孕產(chǎn)婦存在年齡增大、妊娠次數(shù)和流產(chǎn)次數(shù)增多、分娩孕周減小的特點。

轉(zhuǎn)錄因子Twist具有癌基因作用，在多種惡性腫瘤中高表達，引起腫瘤細胞早期轉(zhuǎn)移；而轉(zhuǎn)錄因子Snail 不僅調(diào)控腫瘤細胞遷移，而且與腫瘤細胞侵襲性密切相關(guān)[8]。在正常孕婦胎盤形成過程中，胎兒的叢密絨毛膜進入母體的基蛻膜，從基蛻膜的毛細血管間隙獲取營養(yǎng)，進行母胎間的物質(zhì)交換；而胎盤植入孕婦胎盤形成過程中，滋養(yǎng)細胞向子宮平滑肌間結(jié)締組織和漿膜下浸潤，細胞間連接作用降低甚至缺失，侵襲能力增強是導(dǎo)致胎盤植入發(fā)病的主要因素[9]。本研究通過免疫組化SP法和Western blot實驗均證實，與正常對照組胎盤組織比較，胎盤植入組胎盤組織中Twist、Snail蛋白表達明顯增強，且隨著絨毛植入程度的增加， Twist、Snail蛋白表達呈上升趨勢，表明轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail參與胎盤植入的發(fā)生和發(fā)展過程，故兩種蛋白的表達升高可能參與胎盤植入發(fā)病。

在惡性腫瘤發(fā)展過程中，EMT是指上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞，表現(xiàn)為細胞表型改變，上皮細胞間黏附功能降低，細胞極性消失，運動和遷移功能上升。誘導(dǎo)EMT 的轉(zhuǎn)錄因子如Twist 與Snail表達上調(diào)，結(jié)締組織間充質(zhì)中表型標志物波形蛋白(Vimentin)表達上調(diào)，Vimentin是組成細胞骨架的中間絲蛋白家族成員，表達于各種間充質(zhì)細胞來源的細胞中，為間充質(zhì)細胞及其來源腫瘤的特異性標志物[10]。轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail是EMT中關(guān)鍵的調(diào)控因子，兩者的表達升高引起細胞間連接作用下降，上皮特性減弱，間充質(zhì)細胞表型增強，促進EMT 發(fā)展，最終細胞遷移侵襲能力增強。本研究采用免疫組化檢測顯示，Vimentin蛋白陽性在正常組表達較弱，而胎盤植入組織表達升高，且有隨著胎盤植入程度的加重而逐漸增強趨勢。采用Spearman相關(guān)性分析顯示，胎盤組織中Vimentin陽性表達與Twist蛋白、Snail蛋白呈正相關(guān)性，表明Twist、Snail 蛋白表達升高可能會促進EMT轉(zhuǎn)化，參與胎盤植入發(fā)病，抑制Twist、Snail 蛋白表達可能會降低因胎盤植入導(dǎo)致的嚴重不良妊娠結(jié)局。