李 路, 陳 熙, 武 藝, 徐永偉, 徐元宏，王書書, 沈繼龍

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD) 是一種病因尚不明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC) 和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)。目前的研究[1]表明：遺傳、微生物和環(huán)境因素都會引發(fā)免疫反應(yīng)的異常，進而導(dǎo)致IBD的發(fā)生，其中腸道菌群失調(diào)和免疫功能異常是IBD的重要發(fā)病機制。Strachan[2]提出的“衛(wèi)生假說”認為，過于講究衛(wèi)生、從未有過蠕蟲感染的人群可能更易于患IBD、其他過敏性和自身免疫性疾病。三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型是研究IBD發(fā)病機制的常用動物模型[3]。近年來，越來越多的研究[4]表明，蠕蟲可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg對IBD起到免疫抑制作用。有研究[5]表明，日本血吸蟲蟲卵可通過誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)下調(diào)Th1型反應(yīng)來改善TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。因此，能否在無活體寄生蟲感染的情況下，用蠕蟲蟲源性分子作為一種新的治療策略成為研究熱點。在我國，日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原(Schistosomajaponicumsoluble egg antigens, SjSEA)易于獲得且無毒無害，該研究旨在探討SjSEA對TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的免疫調(diào)節(jié)作用及其機制，為臨床IBD治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物雌性BALB/c小鼠，SPF 級，8～10周，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，在室溫、光照周期12 h ∶12 h 條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d。

1.2實驗材料TNBS購自美國Sigma 公司；內(nèi)毒素去除凝膠(Detoxi-GelTMEndotoxin Removing Gel)購自美國Thermo Scientific公司；髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記抗CD4單抗、PE標記抗IFNγ(interferon-γ，γ干擾素)單抗、APC標記抗IL-4(interleukin-4，白細胞介素4)單抗、APC標記抗CD25單抗，PE標記抗Foxp3(forkhead box P3, 轉(zhuǎn)錄因子)單抗購自美國BD Pharmingen公司。

1.3方法

1.3.1小鼠結(jié)腸炎模型的構(gòu)建 實驗前，小鼠禁食24 h。灌腸液使用5% TNBS和無水酒精的混合物，比例為1 ∶1。在10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用橡膠管經(jīng)肛門插入小鼠結(jié)腸內(nèi)約3.5 cm，注入0.1 ml灌腸液。注射TNBS后，橡膠管保留在原位30 s。接下來，小鼠倒置60 s以確保結(jié)腸持續(xù)暴露在TNBS混合物中。最后將小鼠放回籠子自由飲食。

1.3.2SjSEA的獲取 參照文獻[6]方法日本血吸蟲蟲卵從感染血吸蟲的兔肝臟中無菌采集。在少量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)中將血吸蟲蟲卵研磨成粉末，再將其放入-80 ℃冰凍30 min。此步驟反復(fù)操作3次。在370 r/min、15 min、4 ℃條件下離心獲取上清得到日本血吸蟲蟲卵粗蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測該蟲卵粗蛋白的濃度，其中的脂多糖用內(nèi)毒素去除凝膠清除。

1.3.3實驗分組和實驗方法 Balb/c小鼠分為3組：正常對照組(control)：PBS灌腸+PBS腹腔注射；TNBS造模組(TNBS):TNBS溶液灌腸+ PBS腹腔注射；TNBS+SjSEA 干預(yù)組(TNBS -SjSEA):TNBS溶液灌腸+SjSEA 腹腔注射。 TNBS+SjSEA 干預(yù)組在誘導(dǎo)TNBS結(jié)腸炎后6 h和24 h腹腔注射50 μg SjSEA (在PBS中稀釋至100 μl)，正常對照組和TNBS造模組均腹腔注射等體積PBS。在治療期間，觀察動物的體質(zhì)量和臨床疾病活動指數(shù)。3 d后無痛處死小鼠，檢測結(jié)腸長度、MPO、MAO(宏觀炎癥評分Macroscopic score)和MIO(微觀炎癥評分Microscopic score，MIO)及HE染色。為了探討SjSEA的免疫機制，用流式細胞術(shù)檢測脾淋巴細胞的Th1/Th2細胞和Treg的比例。

1.3.4疾病活動指數(shù) 實驗期間每日觀察小鼠體質(zhì)量變化、大便性狀，每日觀察或用糞便隱血試紙檢測血便情況，按文獻[7]方法行疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)評分。

1.3.5宏觀炎癥評分 造模3 d后無痛處死小鼠，取其結(jié)腸在PBS中仔細清洗。MAO包括結(jié)腸粘連程度、結(jié)腸潰瘍程度、結(jié)腸壁厚和粘膜水腫程度。參照文獻[7]，每個指標的評分從0(正常)到3(嚴重)。評分范圍從最低0分(無炎癥表現(xiàn))到最高12分(嚴重炎癥表現(xiàn))。結(jié)腸長度的改變也是評價結(jié)腸組織炎癥的指標之一[7]。

1.3.6鏡下組織學(xué)評分 造模3 d后無痛處死小鼠，取遠端結(jié)腸用多聚甲醛固定，石蠟包埋后行HE 染色，按照Obermeier et al[8]制定的標準進行組織學(xué)MIO。

1.3.7MPO活性測定 無痛處死小鼠后打開腹腔并取結(jié)腸，制備10%結(jié)腸組織勻漿，結(jié)腸MPO活性通過四甲基聯(lián)苯胺法[7]檢測。

1.3.8淋巴細胞分離及流式細胞儀(Flow cytometry, FACS)分析 在無菌臺將實驗小鼠的脾臟無菌移除，并用1 ml注射器內(nèi)芯研磨。通過200目濾網(wǎng)，加入紅細胞裂解液對脾細胞懸液的紅細胞進行裂解。用70 μm尼龍濾網(wǎng)濾至1.5 ml EP管中，懸浮于RPMI -1640培養(yǎng)基中并調(diào)成濃度為 1×106/ml的細胞懸液。加入細胞刺激劑刺激5 h，破胞膜后分別加入PE-IFNγ、APC-IL-4 抗體固定。對于Treg、脾淋巴細胞加入FITC標記的抗小鼠CD4單克隆抗體和APC標記的抗小鼠CD25單克隆抗體。破核膜后用PE標記的抗小鼠Foxp3單克隆抗體染色。FACS檢測，并利用Flowjo軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1SjSEA對結(jié)腸炎小鼠DAI、體質(zhì)量變化、MAO、結(jié)腸長度的影響造模3 d后，TNBS造模組出現(xiàn)明顯的結(jié)腸炎癥狀，如出現(xiàn)稀便或肉眼血便等癥狀以及體質(zhì)量下降。在TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中，結(jié)腸宏觀表現(xiàn)為粘膜潰瘍、結(jié)腸增厚和水腫，以及嚴重的腹腔粘連。結(jié)果顯示：三組之間在下述指標差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，DAI(F=71.91，P<0.001)；體質(zhì)量變化(F=45.24，P<0.001)；MAO(F=66.35，P<0.001)；結(jié)腸長度(F=13.84，P<0.001)。TNBS-SjSEA組與TNBS-PBS組相比，MAO顯著降低，引起的結(jié)腸炎嚴重程度明顯減輕(P<0.05)，見圖1C。評價炎癥指標還包括 DAI、體質(zhì)量變化、結(jié)腸長度變化。與 TNBS 模型組比較，TNBS- SjSEA組小鼠DAI水平明顯降低，體質(zhì)量回升和結(jié)腸長度縮短明顯改善(P均<0.05)，見圖1。

2.2SjSEA對結(jié)腸炎小鼠MPO的影響與正常組比較，TNBS模型組小鼠的結(jié)腸勻漿MPO水平明顯升高(P<0.05)，提示造模成功。結(jié)果顯示：三組之間均有統(tǒng)計學(xué)意義，MPO(F=32.33，P<0.001)。與TNBS模型組比較，SjSEA干預(yù)后的勻漿MPO活性顯著降低(P<0.05)。見圖2A。

2.3SjSEA對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的影響HE 染色后光鏡下可見TNBS模型組的小鼠結(jié)腸組織病理提示結(jié)腸黏膜及黏膜下層炎性細胞浸潤、聚集成團，局部水腫、糜爛，并伴有潰瘍形成。SjSEA治療后小鼠結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)較完整，部分細胞腫脹，有少量細胞壞死、炎細胞浸潤，與TNBS模型組比較有顯著改善，見圖 3。TNBS組鏡下組織學(xué)評分(MIO)為(6.17±0.75)，TNBS-SjSEA組MIO水平為(3.83±1.47)。結(jié)果顯示：三組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，MIO(F=63.84，P<0.001)。與TNBS組比較，SjSEA治療組MIO水平明顯降低(P<0.05)見圖2B。

圖1 各組小鼠DAI、體質(zhì)量變化、MAO、結(jié)腸長度的變化

A：各組小鼠的DAI分數(shù)；B：各組小鼠的體質(zhì)量變化；C：各組小鼠的MAO大??；D：各組小鼠的結(jié)腸長度變化；與TNBS造模組比較：*P< 0.05

圖2 日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原對結(jié)腸炎小鼠MPO及MIO的影響

2.4SjSEA對小鼠脾臟T淋巴細胞亞群和Treg比例的影響經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示：三組之間在下述指標中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，CD4+IFNγ+(F=27.59，P<0.001)；CD4+IL-4+(F=8.84，P<0.05)；CD4+CD25+Foxp3+(F=21.17，P<0.01)。TNBS造模組小鼠脾臟CD4+IFNγ+占CD4+比例為(2.91±0.66)%，與正常組的小鼠脾臟CD4+IFNγ+(0.44±0.17)% 相比，顯著增加(P<0.05)；與造模組相比，治療組脾臟CD4+IFNγ+(0.68±0.37)%顯著降低(P<0.05)，見圖4。治療組脾臟CD4+IL-4+占CD4+比例為(1.31±0.40)%，與造模組相比，顯著升高(P<0.05)，見圖4。SjSEA治療組CD4+CD25+Foxp3+比例(17.57±4.94)%明顯高于造模組小鼠脾臟(5.70±1.32)%(P<0.05)，見圖5。

3 討論

IBD是由UC和CD組成的腸道自身免疫癥性疾病。盡管臨床上有5- 氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等多種藥物用于治療IBD，但仍有部分患者治療效果不盡人意，不能達到維持緩解的治療目的，并且藥物副作用較多。TNBS誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎模型以 Th1 為主的免疫應(yīng)答為主，類似于人類CD[3]。據(jù)報道，日本血吸蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑(rSjrcystatin)[7]、旋毛蟲重組蛋白 P53(rTsP53)[9]等可明顯減輕 TNBS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥。近年國外相繼開展了蠕蟲及蠕蟲源性分子治療IBD的臨床試驗。一項小樣本臨床試驗報道[10]：4例CD患者和3例UC患者經(jīng)口服用豬鞭蟲卵后，所有患者的臨床活動指數(shù)均有下降，達到了臨床緩解。另一項隨機雙盲、安慰劑對照臨床研究[11]顯示：接受單劑量(可多達7 500個)豬鞭蟲卵對CD患者的治療具有較好的療效及安全性?？紤]到活蠕蟲感染對患者的不利因素(如侵襲性等)，用無毒無害、成分相對簡單的蠕蟲源性分子代替活蠕蟲治療IBD成為趨勢。本課題組探討了SjSEA)對TNBS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的保護作用，實驗結(jié)果顯示，SjSEA可以減輕TNBS誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎的嚴重程度，其中Th2細胞和Treg發(fā)揮了顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。

為評估SjSEA對結(jié)腸炎小鼠臨床癥狀的影響，記錄小鼠體質(zhì)量變化、結(jié)腸長度變化，并給予臨床疾病評分、宏觀疾病評分、鏡下組織學(xué)評分、MPO檢測及結(jié)腸組織HE染色病理檢查。TNBS引起的小鼠結(jié)腸炎以腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕和粘膜潰瘍?yōu)橹饕卣?，炎癥過程還伴隨促炎細胞因子、DAI、MPO、MAO和MIO的急劇增加。本研究結(jié)果顯示，在小鼠實驗性結(jié)腸炎模型組中引起的上述炎癥參數(shù)明顯增加，50 μg SjSEA 6 h、24 h兩次腹腔給藥后，治療組小鼠結(jié)腸炎的臨床癥狀有所緩解，炎癥指標均明顯降低，與既往的文獻報道一致[7]。

圖3 各組小鼠遠端結(jié)腸的HE染色

圖4 各組小鼠脾臟Th1(CD4+IFNγ+)、Th2(CD4+IL-4+)占CD4+比例

圖5各組小鼠脾臟Treg占CD4+比例

與TNBS造模組比較：*P<0.05

為了進一步探討SjSEA抗炎作用的免疫機制，特別是Th1、Th2和Treg細胞之間的平衡，測定了脾臟的T淋巴細胞亞群和Treg比例，實驗結(jié)果表明：與PBS處理的結(jié)腸炎小鼠相比，在SjSEA處理的結(jié)腸炎小鼠的脾臟淋巴細胞中，CD4+IFNγ+明顯降低，CD4+IL-4+顯著升高，表明SjSEA處理后的結(jié)腸脾臟淋巴細胞中Th1反應(yīng)(IFNγ)下調(diào)、Th2反應(yīng) (IL-4)上調(diào)。在不同的蠕蟲種類中包括曼氏血吸蟲卵和日本血吸蟲卵觀察到了類似的結(jié)果[5,12]。同時證明了蠕蟲感染可通過下調(diào)Th1免疫應(yīng)答，激活以IL-4和/或IL-13的大量增殖起主導(dǎo)的Th2免疫應(yīng)答[4]。

蠕蟲及其蟲源性蛋白也可誘導(dǎo)Treg的增殖，促進調(diào)節(jié)性細胞因子(IL-1)和轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factorβ, TGF-β)的分泌，抑制Th1細胞和Th17細胞免疫反應(yīng)所引起的自身免疫性疾病[3]。Denning et al[13]證明了Treg通過阻止Th1效應(yīng)細胞的積累可改善結(jié)腸炎。本研究中SjSEA干預(yù)后的脾臟淋巴細胞與PBS處理的結(jié)腸炎小鼠相比，Treg比例顯著升高，與以往文獻報道一致[7]。因此，本研究的流式細胞檢測數(shù)據(jù)證實了：SjSEA可以通過誘導(dǎo)Th2反應(yīng)來恢復(fù)受干擾的腸道免疫平衡，而Th2反應(yīng)驅(qū)動Th1的下調(diào)，也可誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg減輕結(jié)腸炎癥。因此，本研究結(jié)果表明，Th2細胞和Treg在SjSEA發(fā)揮對結(jié)腸炎癥的保護機制中起重要作用。