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        sFasL及其受體在雙陰性T細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞中的作用及意義

        2018-11-06 09:30:32胡丕波鄔高華周海波趙金錢楊旭東
        關(guān)鍵詞:胰腺癌試劑盒受體

        胡丕波,陳 炯,鄔高華,周海波,趙金錢,楊旭東

        近年來雖然醫(yī)療水平在不斷的進步,癌癥的治療效果逐年提高,但是胰腺癌卻是其中的一個例外,其起病隱匿,病情發(fā)現(xiàn)較晚,且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移,常規(guī)方法治療預(yù)后不佳,5年生存率一直低于5%[1-2]。國際上熱門的“免疫療法”成為癌癥目前治療手段中最有前景的方法之一?!斑^繼免疫”的提出更讓人們看到了治愈腫瘤的曙光。其中雙陰性T細(xì)胞(double negative T cell,DNT cell)由于其明顯的抗腫瘤作用引起了眾多研究者的關(guān)注。楊仁保 等[3]在利用裸鼠模型進行的體內(nèi)實驗中顯示DNT細(xì)胞可以殺傷胰腺癌細(xì)胞,但是其具體的殺傷機制尚無定論。Chang et al[4]研究報道了可溶性的FasL與其受體Fas結(jié)合介導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡,這為課題組提供了新的思路。該研究的目的是探索sFasL/Fas是否參與了DNT細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞。

        1 材料與方法

        1.1病例資料人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1、BXPC-3、Capan-1(中科院上海細(xì)胞庫)。人胰腺癌組織蠟塊標(biāo)本和癌旁組織蠟塊標(biāo)本各60例(距離癌組織>1 cm)。均取自2014年3月~2017年8月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院膽胰外科行切除術(shù)且病理證實為胰腺癌的組織。其中男34例,女26例;年齡(60.15±12.32)歲。所選患者術(shù)前均未進行過放療、化療等抗腫瘤治療。同時收集這60例胰腺癌患者的臨床病理資料。分離DNT細(xì)胞的人外周血標(biāo)本取自未服用藥物、無免疫性疾病的健康人群。腫瘤分期參照美國癌癥委員會TNM分期手冊第7版。

        1.2主要試劑胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司);FasL ELISA試劑盒(美國R&D Systems 公司);CD4 +、CD8 + 去除液(加拿大Stemcell Technologies 公司);白介素2(interleukin-2, IL-2)、白介素4(IL-4)、抗人T 淋巴細(xì)胞表面CD3 (OKT3)抗體(美國eBioscience 公司);人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋公司);兔抗人Fas抗體(英國Abcam公司);蛋白提取試劑盒(南京Keygen 公司);實時定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司);TRIzol(美國Invitrogen 公司)。

        1.3實驗方法

        1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) DNT細(xì)胞的培養(yǎng)采用OKT3抗體吸附法。將CD4、CD8去除液(50 μl/ml)加入肝素鈉抗凝的10 ml健康人外周血中,靜置孵育20 min后,緩慢加入到含有等量淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,保持液面分層然后離心,吸取中間云霧層細(xì)胞兩次洗滌,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,然后接種到OKT3包被的培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5%CO2恒溫條件下靜置培養(yǎng),每隔3 d滴加IL-2(1 μl/ml)和IL-4(1 μl/ml)促進生長。2~3 d換液,6 d移至較大的培養(yǎng)瓶中,12~13 d使用細(xì)胞。胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng):3株胰腺癌細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基靜置于37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng),2~3 d換液傳代。

        1.3.2Fas mRNA 檢測 采用qRT-PCR法,首先按照TRIzol試劑盒說明書提取3株胰腺癌細(xì)胞的RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。使用qPCR試劑盒進行擴增反應(yīng),反應(yīng)體系為10 μl。Fas上游引物:5′- TTGCTTAGGGTTCCCTCCTG-3′,下游引物:5′-AAACTGGAGAGCAGACAGCA-3′。β-actin上游引物:5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG -3′,下游引物:5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG -3′。qPCR循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計算mRNA表達(dá)量,實驗重復(fù)3次。

        1.3.3Fas蛋白檢測 采用Western blot法,收取3株胰腺癌細(xì)胞并加入RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白,按照1 ∶4加入5×上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min冷卻后上樣,SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉封閉;滴加Fas一抗,4 ℃過夜;加入適當(dāng)稀釋度的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h,然后PBST洗滌3次;加入ECL曝光液,曝光顯影后,使用Image J軟件進行條帶分析。

        1.3.4sFasL檢測 采用ELISA法,將DNT細(xì)胞(5×106/ml)的培養(yǎng)液(換液過夜)作為實驗組,將未培養(yǎng)DNT細(xì)胞的培養(yǎng)液(換液過夜)作為對照組,各取100 μl進行檢測,按照ELISA試劑盒進行操作,讀取OD值,計算兩組sFasL的濃度。

        1.3.5人胰腺癌組織Fas蛋白檢測 采用免疫組化法,取胰腺癌石蠟切片脫蠟后檸檬酸鹽高壓修復(fù),緩慢冷卻至室溫,然后使用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑消除內(nèi)源性過氧化物酶活性(30 min),PBS沖洗3次,再滴加一抗Fas(1 ∶200),4 ℃過夜,次日室溫下放置30 min,PBS沖洗3次,隨后滴加二抗孵育30 min,PBS沖洗3次,加入適量DAB顯色,自來水沖洗,蘇木精復(fù)染,烘箱烘干,最后中性樹脂封片。

        1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進行分析,兩組均數(shù)比較采用t檢驗,3組均數(shù)比較采用方差分析,定性資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1DNT細(xì)胞鏡下形態(tài)DNT細(xì)胞從健康人外周血中分離提取,最初細(xì)胞數(shù)量較少(1×105/ml),呈現(xiàn)懸浮生長狀態(tài),經(jīng)過IL-2和IL-4的促進生長作用,細(xì)胞數(shù)量緩慢增加,13 d左右的可達(dá)到飽和狀態(tài)(細(xì)胞數(shù)量為5×106/ml),見圖1。

        圖1 DNT細(xì)胞形態(tài) ×200

        2.2FasmRNA在3種胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異PCR結(jié)果顯示mRNA在3種胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)均有表達(dá),3組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=211.56,P<0.05),相互比較結(jié)果顯示Capan-1表達(dá)量低于BXPC-3(P<0.05),Panc-1表達(dá)量高于BXPC-3(P<0.05),見圖2。

        圖2 3種胰腺癌細(xì)胞中Fas mRNA的表達(dá)情況

        1: Capan-1; 2: BXPC-3; 3: Panc-1; 與BXPC-3細(xì)胞比較:*P<0.05

        2.3Fas蛋白在3種胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異Western blot結(jié)果顯示Fas蛋白在3種細(xì)胞中均有較高表達(dá),由低到高順序為Capan-1、BXPC-3、Panc-1。見圖3、4。

        圖3 3種胰腺癌細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)情況

        圖4 3種胰腺癌細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)量1:Capan-1; 2: BXPC-3; 3:Panc-1

        2.4sFasL在DNT細(xì)胞培養(yǎng)液中的含量ELISA法檢測了20例健康人外周血來源分離培養(yǎng)的DNT細(xì)胞(5×106/ml)上清液以及未培養(yǎng)DNT細(xì)胞的上清液,結(jié)果顯示培養(yǎng)DNT細(xì)胞組上清液中sFasL含量為(64.52±2.21)pg/ml,對照組上清液中含量為(55.68±1.95)pg/ml,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.00,P<0.01)。見圖5。

        圖5 DNT細(xì)胞上清液和對照組中sFasL的含量與對照組比較:**P<0.01

        2.5Fas在胰腺癌和癌周組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示Fas蛋白主要的表達(dá)部位是在細(xì)胞質(zhì),胰腺癌組織的陽性表達(dá)率為42%(25/60),在癌周組織的陽性表達(dá)率為68%(41/60),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.62,P<0.05)。見圖6。

        圖6 Fas蛋白在胰腺癌和癌周組織中的表達(dá)情況 ×200

        A:Fas在胰腺癌組織中的陰性表達(dá);B:Fas在胰腺癌周組織中的陽性表達(dá)

        2.6Fas的表達(dá)與臨床資料的相關(guān)性Fas在胰腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤的分化程度、神經(jīng)浸潤有關(guān)(χ2=5.659、6.251,P<0.05),而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)。見表1。

        表1胰腺癌組織中Fas蛋白的表達(dá)與臨床病理關(guān)系(n)

        臨床病理特征nFas陽性例數(shù)Fas陰性例數(shù)χ2值P值性別 男3416180.9390.333 女26917年齡(歲) ≤602710170.4330.511 >60331518腫瘤位置 胰頭3116152.6110.106 胰尾29920分化程度 高231495.6590.017 中低371126TNM分期 Ⅰ~Ⅱ3818201.3860.239 Ⅲ~Ⅳ22715神經(jīng)浸潤 有339246.2510.012 無271611淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有3819192.9610.085 無22616

        3 討論

        胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤,雖然現(xiàn)代外科技術(shù)的發(fā)展使胰十二指腸切除術(shù)圍手術(shù)期死亡率降至5%以下,但是30年來胰腺癌的長期存活率并未發(fā)生顯著改變。DNT細(xì)胞在各項疾病中均起到了關(guān)鍵的治療作用,特別是其抗腫瘤作用已成為人們關(guān)注的點。Lee et al[5]研究發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞可以抑制急性白血病細(xì)胞的生長。Xu et al[6]通過實驗證明了DNT細(xì)胞通過NK細(xì)胞活化性受體(NKG2D) 及其配體主要組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)基因A(MICA)途徑殺傷胰腺癌細(xì)胞。最近有研究[4]報道sFasL/Fas可以介導(dǎo)殺傷肺癌細(xì)胞。而本研究在DNT細(xì)胞上清液中檢測出了sFasL的表達(dá),同時在胰腺癌細(xì)胞中檢測出其受體Fas的高表達(dá),所以筆者有理由推測DNT細(xì)胞可以通過分泌sFasL與胰腺癌細(xì)胞表面的Fas結(jié)合介導(dǎo)殺傷胰腺癌細(xì)胞。

        Fas是屬于TNF受體超家族成員的I型跨膜蛋白,與腫瘤壞死因子(TNF)受體具有一定的同源性。Fas的基因位于10號染色體,其基因分子長度為25 kb,共編碼了325個氨基酸。Fas蛋白可分為膜表達(dá)型(mFas)和可溶型(sFas)兩種形式。mFas分為3個部分:胞外部分、跨膜部分、胞內(nèi)部分,其中胞內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域,可傳遞細(xì)胞凋亡信號。FasL屬于TNF配體超家族,是一種分子量40 ku的Ⅱ型跨膜蛋白,其基因位于1號染色體,共編碼281個氨基酸,其蛋白分子同樣也分為膜型(mFasL)和可溶型(sFasL)。Fas與FasL在體內(nèi)是天然的受體與配體關(guān)系。Fas與FasL結(jié)合后,凋亡信號開始傳遞,受體分子中的死亡結(jié)構(gòu)域構(gòu)像改變,然后通過與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Fas-associated death domain, FADD)的C末端結(jié)合傳遞信號,信號在FADD中又通過N末端與caspase8結(jié)合,開啟半胱氨酸蛋白酶(caspase)分子的級聯(lián)反應(yīng),使得細(xì)胞凋亡[7-9]。Fas與FasL的結(jié)合,是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟,所以癌細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)量對研究FasL是否參與細(xì)胞凋亡具有重要意義。

        表達(dá)Fas的靶細(xì)胞與FasL結(jié)合后,靶細(xì)胞就會被誘導(dǎo)進入死亡程序,維持著人體細(xì)胞凋亡與增殖的平衡[10]。本研究在胰腺癌細(xì)胞和組織中均檢測了Fas的表達(dá)情況,其結(jié)果為:Fas mRNA在3株胰腺癌細(xì)胞中均有表達(dá)且存在一定差異,F(xiàn)as蛋白在胰腺癌細(xì)胞中均有較高表達(dá)且表達(dá)差異與RNA的表達(dá)差異一致。而在免疫組化法檢測胰腺癌組織和癌周組織的結(jié)果中顯示:Fas蛋白在胰腺癌組織中表達(dá)較癌周組織表達(dá)較低,且低分化組織中的表達(dá)量明顯低于高分化組織。從中可以表明,F(xiàn)as在胰腺癌組織中的表達(dá)下調(diào),與其配體FasL的結(jié)合減少,導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞凋亡減少,發(fā)生免疫逃逸,細(xì)胞凋亡與增殖的動態(tài)平衡被打破,使得胰腺癌快速的發(fā)生發(fā)展得以進行。

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