常曉燕, 吳啟美， 江 肖，吳永貴

現(xiàn)階段慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)已經(jīng)成為全球性公共健康問題，其患病率和病死率極高，其中很大一部分患者可進(jìn)展至終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)。腎臟纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展至ESRD的共同途徑；腎臟纖維化是一個動態(tài)進(jìn)展過程，包括啟動、活化、持續(xù)、進(jìn)展等，在此過程中涉及多種信號通路及細(xì)胞因子的活化，其中Wnt/β-Catenin信號通路是被證實參與腎臟組織纖維化的重要信號通路[1]。

該研究所涉及到的一種藥物氯硝柳胺，商品名：滅絳靈、蕩絳靈、硝硫苯酯、育米生等，為美國 FDA已批準(zhǔn)用藥，既往主要用于腸道寄生蟲感染，哺乳動物低毒性。氯硝柳胺難溶于水，腸道中很難吸收，前期的研究[2-3]在其原有的側(cè)鏈上加一磷酸基團，即氯硝柳胺磷酸酯(phosphate niclosamide，P-NICLO)，該衍生物可明顯增加藥物水溶性而不明顯影響其化學(xué)效應(yīng)，大大擴展了其研究應(yīng)用范圍[2-3]。該文中所提及的用藥均為氯硝柳胺的水溶性衍生物即P-NICLO。既往研究[2-3]顯示，氯硝柳胺在腫瘤細(xì)胞中可以通過顯著抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活化而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。腎臟纖維化進(jìn)展過程中，Wnt/β-Catenin信號通路也處于活化狀態(tài)，P-NICLO在腎臟組織纖維化過程中是否有類似抑制Wnt/β-Catenin信號通路的作用尚未可知。該研究旨在探討P-NICLO是否通過抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活化而抑制腎臟組織纖維化。

1 材料與方法

1.1實驗動物與細(xì)胞雄性BALB/c小鼠，20～25 g，購自并飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E美國ATCC來源細(xì)胞株。該研究動物實驗經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：20170371)。

1.2主要試劑與儀器Wnt/β-Catenin信號通路相關(guān)抗體anti-β-Catenin、anti-active-β-Catenin (即anti-ABC)購自美國Millipore公司；抗纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAL1)即anti-PALI購自美國Santa Cruz公司；抗基質(zhì)金屬蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP7)即anti-MMP7購自美國GeneTex公司；anti-Snai購自美國Cell signaling公司；Real-Time PCR儀(7500Fast)購自美國ABI公司；Bio-Rad電泳儀購自美國BIO-RAD公司；TRIzol 試劑及TaKaRa試劑盒(Cat.No:RR047A)購自美國Invitrogen公司。

1.3實驗動物及細(xì)胞模型建立

1.3.1動物模型及分組 雄性BALB/c小鼠20～25 g，行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后，隨機分為3組：Sham組、單側(cè)輸尿管梗阻模型(unilateral ureteral obstruction，UUO)組、UUO+P-NICLO組，每組5只。用藥組P-NICLO用0.9%氯化鈉注射液溶解，術(shù)天第7天開始30 mg/kg劑量腹腔注射，每日1次；UUO陽性對照組予以相應(yīng)劑量的生理鹽水腹腔注射，術(shù)后第14天處死小鼠取組織。

1.3.2細(xì)胞模型及分組 大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK52E傳代分皿后，分組如下：① CTRL(Control)組：無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；② TGFβ1組：含10 ng/ml TGFβ1無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h收取蛋白；③ P-NICLO藥物干預(yù)組：P-NICLO按照濃度梯度預(yù)處理細(xì)胞1 h后加TGFβ1 10 ng/ml繼續(xù)無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后收細(xì)胞。所有實驗重復(fù)3次。

1.4樣本制備

1.4.1動物實驗標(biāo)本制備 所有小鼠術(shù)后第14天處死，處死小鼠時，左心室抽血，右心房切一小口，予以約20 ml冰PBS灌注左心室至腎臟蒼白色，收集兩側(cè)腎臟備用。取左側(cè)病變腎臟上極置于10%福爾馬林溶液中固定，4 ℃至少放置24 h后，脫水，石蠟包埋，做常規(guī)病理檢測。收集其余左側(cè)病變腎臟皮質(zhì)部分，用液氮冷凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)涞鞍准敖M織RNA的提取。

1.4.2細(xì)胞實驗標(biāo)本收集 Western及IP細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，行Western blot檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)：α-SMA、Fibronectin(FN)、CollagenI(COL1)以及β-Catenin信號通路相關(guān)指標(biāo)：β-Catenin 、active-β-Catenin以及β-Catenin信號通路靶蛋白PAL1、MMP7、Snail等的表達(dá)。

1.5實驗方法

1.5.1光鏡 標(biāo)本取出后 ，進(jìn)行脫水，包埋，切片, Masson染色。腎臟皮質(zhì)部位顯微鏡400×視野下隨機選取至少15個視野，然后應(yīng)用Image pro-Plus6.0軟件，計算陽性染色區(qū)域的積分光密度(integrated option density,IOD)值，陽性染色區(qū)域的IOD/圖片總面積所得出的數(shù)值再進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5.2Western blot 超聲震蕩打碎的腎臟組織或收集的細(xì)胞，用Western或IP裂解液冰上裂解30 min(裂解液中需加入一定比例的蛋白酶抑制劑)，提取總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%BSA 室溫封閉2 h，按照說明書分別加入一定濃度的一抗及二抗封閉，加DAB 顯色液，曝光顯影并拍照保存，以GAPDH 為內(nèi)參驗證蛋白含量。

1.5.3Real-time PCR 根據(jù)TRIzol試劑說明書及TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行操用，具體步驟如下： TRIzol裂解液裂解組織或細(xì)胞，然后提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，最后按照說明書依次將反應(yīng)體系加入7500 Fast Real-time PCR的反應(yīng)體系中，行PCR擴增檢測。動物實驗Real-time PCR引物：GADPH F：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′；R：5′-CTC GCTCCTGGAAGATGGTG-3′；MMP7 F ：5′-TAGGCGG AGATGCTCACTTT-3′；R：5′-TTCTGAATGCCTGCAA TGTC-3′；PAL1 F：5′-GTTCATCGCTGCACCCTTTG-3′；R：5′-CTGCTCTTGGTCGGAAAGACT-3′；Snail F ：5′-ATTCTCCTGCTCCCACTGC-3′；R：5′-GACTCTTG GTGCTTGTGGAG-3′。

2 結(jié)果

2.1P-NICLO對腎臟纖維化的干預(yù)作用實驗過程中，小鼠無明顯厭食，腹瀉，活動度下降等不良反應(yīng)，無發(fā)生死亡，提示P-NICO毒性相對較低。MASSON染色顯示UUO+P-NICLO組腎臟組織膠原纖維沉積明顯減輕，與UUO組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot結(jié)果也表明，動物模型中UUO+P-NICLO組纖維化指標(biāo)α-SMA、Fibronectin、CollagenI表達(dá)均顯著降低，與UUO組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1、表1)。細(xì)胞實驗進(jìn)一步證實了上述論點，TGFβ1體外刺激NRK52E細(xì)胞，使其活化產(chǎn)生促纖維化因子，P-NICLO預(yù)處理細(xì)胞可以明顯下調(diào)纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，與TGFβ1組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2、表2)。

A、B：各組小鼠腎臟皮質(zhì)(MASSON染色×400)及其膠原纖維沉積的定量分析；C、D： Western blot檢測各組小鼠纖維化蛋白表達(dá)及其定量分析；與Sham組比較：*P<0.05；與UUO組比較：#P<0.05

表1 Western blot檢測各組動物腎臟組織纖維化蛋白的表達(dá)

與Sham組比較：*P<0.05；與UUO組比較：#P<0.05

表2 Western blot檢測各組NRK52E細(xì)胞促纖維化因子的表達(dá)

與CTRL組比較：*P<0.05；與TGFβ1組比較：#P<0.05

表3 Western blot檢測各組動物腎臟組織β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

與Sham組比較：*P<0.05；與UUO組比較：#P<0.05

表4 Western blot檢測各組NRK52E細(xì)胞β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

與CTRL組比較：*P<0.05；與TGFβ1組比較：#P<0.05

圖2 P-NICLO對 NRK52E細(xì)胞促纖維化因子表達(dá)的影響

2.2P-NICLO對腎臟纖維化β-Catenin信號通路的干預(yù)作用體內(nèi)實驗(圖3、表3)及體外實驗(圖4、表4)都證實P-NICLO可以使總β-Catenin及活化的β-Catenin表達(dá)均顯著下調(diào)，進(jìn)而抑制其下游信號通路的活化，使其靶基因(PALI1、MMP7、Snail)表達(dá)水平均顯著下調(diào)，與UUO組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

腎臟纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展至ESRD的共同途徑，但目前臨床上尚缺乏有效抑制腎臟組織纖維化的藥物，如何更有效地抑制腎臟組織纖維化，延緩CKD進(jìn)展至ESRD需要腎臟替代治療的時間無疑是當(dāng)前腎臟病衛(wèi)生戰(zhàn)略重點之一。

圖3 P-NICLO對UUO模型β-Catenin信號通路活化的影響

A、B：Western blots示各組小鼠β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及其定量分析；C～E：Real-time PCR示各組小鼠β-Catenin信號通路靶基因PAL1(C)、MMP7(D)、Snail(E) mRNA水平的表達(dá)；與Sham組比較：*P<0.05；與UUO模型組比較：#P<0.05

圖4 P-NICLO對NRK52E細(xì)胞β-Catenin信號通路活化的影響

與CTRL組比較：*P<0.05；與TGFβ1組比較：#P<0.05

研究[4]顯示腎臟組織纖維化發(fā)生及進(jìn)展涉及腎臟組織的所有細(xì)胞成分，如小管、小管間質(zhì)、腎小球、血管內(nèi)及募集到腎臟組織的骨髓源性細(xì)胞(如單核細(xì)胞、纖維細(xì)胞)等。腎臟組織纖維化是一個動態(tài)進(jìn)展過程，包括啟動、活化、持續(xù)、進(jìn)展等，在此過程中涉及多條信號通路及細(xì)胞因子的活化[1]。目前研究比較多的與腎臟組織纖維化相關(guān)的信號通路包括TGFβ/Smad信號通路、Wnt/β-Catenin信號通路、NF-κB信號通路、RASS信號通路等。這些信號通路在腎臟組織纖維化的發(fā)生及進(jìn)展過程中均有不同程度的活化，參與調(diào)節(jié)腎臟組織纖維化發(fā)生及發(fā)展，且各條信號通路并不是孤立存在而是相互關(guān)聯(lián)相互影響，存在“串話”效應(yīng)[1,5]，大量基礎(chǔ)實驗及臨床研究通過制備靶向抑制上述信號通路的藥物，用于抗腎臟纖維化治療，并已取得一定成效[6-7]。

該研究所涉及的Wnt/β-Catenin信號通路是一種經(jīng)典的信號通路，在動物的生長發(fā)育及病理生理變化中發(fā)揮重要作用。在此信號通路中，β-Catenin是一種細(xì)胞骨架蛋白，與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-連環(huán)蛋白(α-catenin)等形成黏附復(fù)合體，在細(xì)胞-細(xì)胞黏附中起重要作用[8-9]。β-Catenin除形成復(fù)合體外，還是Wnt/β-Catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Wnt蛋白同時與跨膜卷曲蛋白受體Frizzled(Fzd)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)結(jié)合，然后激活下游disheveled(Dsh)蛋白，Dsh活化后，進(jìn)一步激活ZW3/GSK3,使β-Catenin磷酸化減少，無法及時降解而在胞質(zhì)內(nèi)堆積，過度堆積的β-Catenin可轉(zhuǎn)位入核，與核轉(zhuǎn)錄因子即T 細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強結(jié)合因子(LEF)結(jié)合組成復(fù)合物，再募集共活化因子環(huán)磷酸腺苷(cAMP)效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)結(jié)合蛋白(CBP)，從而激活Wnt/β-Catenin靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括常見的Snail、PAL1、MMP7等[8]。細(xì)胞內(nèi)β-Catenin水平是Wnt信號通路中的重要調(diào)節(jié)靶點。β-Catenin在細(xì)胞內(nèi)的水平受正性調(diào)節(jié)因子和負(fù)性調(diào)節(jié)因子的競爭性調(diào)節(jié)，負(fù)性調(diào)節(jié)因子是由GSK/ZW3、Axin及APC一組蛋白組成的復(fù)合體，主要作用是破壞β-Catenin的穩(wěn)定性，使β-Catenin在細(xì)胞內(nèi)降解處于高水平，從而關(guān)閉Wnt途徑。正性調(diào)節(jié)因子包括另一類拮抗類的蛋白，包括Disheveled及TCF-Grouch-CBP等，在對Wnt信號反應(yīng)時被活化，起拮抗破壞復(fù)合物的作用，使細(xì)胞內(nèi)的β-Catenin水平升高，從而啟動Wnt信號[8-9]。

Wnt/β-Catenin信號通路在腎臟發(fā)育過程中處于活化狀態(tài)，腎臟發(fā)育成熟后處于靜止?fàn)顟B(tài)，腎臟疾病時重新活化[8-9]。在很多腎纖維化模型中均可以發(fā)現(xiàn)Wnt/β-Catenin信號通路的激活，而選擇性的抑制這一通路可以明顯減輕腎臟纖維化。如近年來研究[9-10]顯示小分子肽類化合物ICG-001，可特異性的干擾Wnt/β-Catenin信號通路。ICG-001通過結(jié)合CBP從而干擾β-Catenin/CBP的相互作用，已經(jīng)證明其在小鼠模型上能夠逆轉(zhuǎn)甚至阻斷腎臟纖維化，但只處于臨床前研究，需進(jìn)一步驗證。Wnt/β-Catenin信號通路還可以直接調(diào)控RASS相關(guān)蛋白基因而影響腎臟病的進(jìn)展。研究[10-11]表明選擇性抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活化是腎臟纖維化治療的另一個重要靶點。

既往研究Wnt/β-Catenin信號通路特異性抑制物大多為新合成化合物，其性能及安全性還有待進(jìn)一步驗證。本研究所涉及的藥物P-NICLO是FDA已批準(zhǔn)用藥即氯硝柳胺的水溶性衍生物，該藥物在腎臟組織纖維化防治中的作用尚無相關(guān)研究。既往研究[12-13]氯硝柳胺藥理作用時顯示，在腫瘤細(xì)胞中，氯硝柳胺可以通過抑制β-Catenin信號通路的活性抑制腫瘤細(xì)胞的增生。Chen et al[12]發(fā)現(xiàn)在人類骨肉瘤U2OS細(xì)胞中，氯硝柳胺主要通過促進(jìn)Wnt受體Fzd1內(nèi)吞，抑制Wnt信號調(diào)節(jié)蛋白 Dsh的表達(dá)等多方面抑制β-Catenin信號通路；在人類結(jié)腸癌細(xì)胞系中，也發(fā)現(xiàn)類似作用[13]；但是在人類前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞中，氯硝柳胺主要通過促進(jìn)Wnt共受體LRP6的降解而抑制β-Catenin信號通路的活化，而對Dsh蛋白表達(dá)無影響；表明氯硝柳胺抑制β-Catenin信號通路的作用機制具有細(xì)胞特異性[13-14]。

該研究通過設(shè)計體內(nèi)體外實驗證實腎臟纖維化模型中，P-NICLO可特異性抑制β-Catenin總蛋白及活化β-Catenin蛋白形成，進(jìn)而抑制下游靶蛋白PALI1、MMP7、Snail等表達(dá)，最終抑制腎臟組織纖維化，為腎臟纖維化的防治提供新的思路。但P-NICLO如何抑制β-Catenin總蛋白及活化β-Catenin蛋白的形成，其抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活化是否還有其他機制參與尚未可知，有待進(jìn)一步研究證實。