崔曉宇，王國(guó)芳，李小紅，張 朋 ，李冬雪，軒亞茹

牙周炎是由菌斑微生物與宿主組織相互作用引起的牙周支持組織的炎性感染性疾病，主要表現(xiàn)為軟組織破壞和牙槽骨喪失，是成年人牙齒松動(dòng)和脫落的首要原因[1]。近年來，各種證據(jù)表明氧化應(yīng)激在牙周炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中起重要作用。在炎癥狀態(tài)下，活性氧自由基的過度產(chǎn)生導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激和抗氧化防御系統(tǒng)失衡，從而對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷[2]。減少氧化損傷和增加抗氧化能力是治療牙周病的關(guān)鍵。β-隱黃素，是一種已被證實(shí)的具有多種生物活性的類胡蘿卜素，廣泛存在于柑橘、玉米、豌豆等多種果蔬中，其生物安全性已被認(rèn)證[3]。Liu et al[4]研究顯示β-隱黃素可以抑制鎘誘導(dǎo)的大鼠睪丸組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，推測(cè)β-隱黃素可能在牙周組織的氧化應(yīng)激中具有一定的保護(hù)作用。然而，有關(guān)此方面的研究尚未見報(bào)道。該研究旨在初步探討β-隱黃素如何影響內(nèi)毒素(lipopolysaccharide, LPS)/結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑及器械β-隱黃素(美國(guó)Sigma公司)；LPS(索萊寶生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)；顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)； Leica SM 2000R切片機(jī)(德國(guó)徠卡Microsystems Nussloch公司)；TDL-5離心機(jī)(上海安寧科學(xué)儀器廠)；DW-86L626立式超低溫保存箱(青島海爾公司)；顯微外科器械。

1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象選取8周齡雄性 SD大鼠30只，280～330 g，由山東省濟(jì)南市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(魯)2014-0007。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.3牙周炎動(dòng)物模型的建立方法隨機(jī)取10只大鼠為正常對(duì)照組，剩余動(dòng)物以7%的水合氯醛按3 ml/kg體重腹腔注射麻醉。采用口腔正畸結(jié)扎絲(直徑0.2 mm)環(huán)繞雙側(cè)上頜第二磨牙牙頸部一圈，結(jié)扎絲盡量靠近齦緣，于腭側(cè)打結(jié)壓向牙齒舌面，盡量避免損傷牙齦上皮。定期觀察結(jié)扎絲是否移位或脫落。同時(shí)在相應(yīng)牙頰腭側(cè)齦溝內(nèi)注射LPS(30 μl/只)[5]，每48 h注射1次。當(dāng)牙齦出現(xiàn)紅腫、糜爛、輕探易出血、牙齒松動(dòng)等癥狀時(shí)則造模成功。將20只建模成功的牙周炎大鼠再隨機(jī)分為牙周炎組和β-隱黃素治療組。β-隱黃素治療組在注射LPS后于相同位點(diǎn)注射β-隱黃素(12 μg/只)[6]，每48 h一次。作為對(duì)照，牙周炎組注射等劑量的生理鹽水。

1.4樣本采集于給藥后第7天，以10%水合氯醛5 ml/kg腹腔注射深度麻醉后行腹主動(dòng)脈采血，室溫下靜置30 min～1 h, 3 000 r/min離心15 min取上清液，分裝至已登記編號(hào)的離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用脫頸法處死大鼠，取雙側(cè)上頜骨。左側(cè)上頜骨(含牙齦、牙齒、牙槽骨)稍作修剪去除多余組織后，置于10%中性福爾馬林固定液中，登記編號(hào)，4 ℃保存?zhèn)溆?。右?cè)上頜骨取第二磨牙周圍牙齦組織，立即以4 ℃冰生理鹽水漂洗去除表面血液，濾紙吸干，分裝編號(hào)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5組織病理學(xué)分析左側(cè)上頜骨固定48 h以上后，取出結(jié)扎絲，并在10% EDTA脫鈣液中脫鈣，脫水，二甲苯清洗，石蠟包埋。沿磨牙近遠(yuǎn)中方向切成4 μm的切片，每個(gè)樣本收集3張切片，用HE溶液染色，顯微鏡下挑片，進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.6牙齦組織和血清中相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)牙齦組織：組織塊稱重，冰浴速剪置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH 7.4，0.01 mol/L 蔗糖，0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA2Na 溶液)按組織塊重量：勻漿介質(zhì)體積為1 ∶9制備10%的組織勻漿, 4 ℃、3 000 r/min離心15 min, 取上清液。血清：復(fù)溫至室溫。采用試劑盒檢測(cè)牙齦組織和血清中的 MDA、SOD及GSH-Px的活性： MDA檢測(cè)采用硫代巴比妥酸法(TBA法)；SOD檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法；GSH-Px活力檢測(cè)采用雙硫代對(duì)硝基苯甲酸比色法(DTNB法)，以上操作均嚴(yán)格遵守試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1組織學(xué)分析-HE染色結(jié)果選擇大鼠上頜第一和第二磨牙之間的區(qū)域?yàn)榇恚瑘D像放大40倍：正常對(duì)照組大鼠牙周組織包括充滿鄰間隙的牙齦乳頭，牙槽骨嵴頂外形邊緣整齊，結(jié)合上皮附著于釉牙骨質(zhì)界處(cemento-enamel junction, CEJ)，見圖1A1；相反，牙周炎組結(jié)合上皮位于CEJ的根方，于牙面剝離，有深牙周袋形成，見圖1B1；β-隱黃素治療組結(jié)合上皮位于CEJ稍下方處，牙周袋變淺，見圖1C1。圖像放大200倍：正常對(duì)照組結(jié)締組織內(nèi)有極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周膜纖維排列有序，見圖1A2；牙周炎組結(jié)締組織內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維排列紊亂甚至斷裂，牙周膜間隙增寬，牙槽骨出現(xiàn)不規(guī)則吸收，嵴頂邊緣不整，見圖1B2中a、b標(biāo)記處；β-隱黃素治療組結(jié)締組織內(nèi)見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周膜纖維排列整齊，牙周膜間隙稍增寬，牙槽嵴頂邊緣較整齊，有少量骨吸收，見圖1C2中c、e標(biāo)記處。

圖1 大鼠磨牙間牙周組織學(xué)觀察 HE染色

A:正常對(duì)照組；B:牙周炎組；C: β-隱黃素治療組；1：×40；2×200；G:結(jié)締組織；PL:牙周韌帶；D:牙本質(zhì)；AB:牙槽骨；黑色箭頭所示為釉牙骨質(zhì)界(CEJ)

2.2氧化標(biāo)志物水平檢測(cè)牙齦組織中MDA含量、SOD和GSH-Px活性的變化：與正常對(duì)照組比較，牙周炎組MDA的生成水平顯著增高且SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與牙周炎組比較，β-隱黃素治療組MDA的生成水平顯著降低且SOD和GSH-Px活性明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 β-隱黃素給藥對(duì)大鼠牙齦組織中MDA、SOD、GSH-Px的影響

與正常對(duì)照組比較：#P<0.05; 與牙周炎組比較：*P<0.05

表2 β-隱黃素給藥對(duì)大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px的影響

與正常對(duì)照組比較：#P<0.05; 與牙周炎組比較：*P<0.05

血清中MDA含量、SOD和GSH-Px活性的變化：與正常對(duì)照組比較，牙周炎組MDA的生成水平顯著增高且SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與牙周炎組比較，β-隱黃素治療組MDA的生成水平顯著降低且SOD和GSH-Px活性明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

牙周炎的發(fā)生是多種危險(xiǎn)因素作用的結(jié)果，其中牙周致病菌刺激宿主免疫/炎癥反應(yīng)，使得中性粒細(xì)胞(PMN)和吞噬細(xì)胞被趨化和激活，侵入牙周組織并誘導(dǎo)蛋白水解酶的釋放和活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生。ROS的大量產(chǎn)生引發(fā)了一系列降解和破壞細(xì)胞膜的連鎖反應(yīng)并生成過氧化脂質(zhì)，最終分解成次級(jí)產(chǎn)物如MDA。另一方面，機(jī)體產(chǎn)生各種抗氧化酶以抵消過量的ROS并修復(fù)損傷，包括SOD、過氧化氫酶(CAT)和GSH-Px。當(dāng)機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)不能及時(shí)清除有害的ROS時(shí)，ROS將在組織內(nèi)蓄積，導(dǎo)致氧化應(yīng)激形成，造成或加重牙周組織損傷[7]。因此，尋求具有抗氧化作用且副作用少，成本較低的化合物是防治牙周炎的一種重要途徑。

近年來，Sanbe et al[8]研究表明非酶促抗氧化劑的攝入可降低牙周病變組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目和脂質(zhì)過氧化的水平，提高牙周炎的愈合能力。β-隱黃素作為一種具有抗氧化性能的天然化合物[4]，可能對(duì)緩解牙周炎的發(fā)病進(jìn)程起有效作用。本實(shí)驗(yàn)使用LPS/結(jié)扎聯(lián)合誘導(dǎo)牙周炎動(dòng)物模型，建模大鼠5 d后出現(xiàn)牙齦緣紅腫糜爛，輕度萎縮，輕探出血。頜骨組織病理學(xué)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，牙周炎組結(jié)合上皮根方遷移，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和牙槽骨破壞明顯，說明本實(shí)驗(yàn)成功建立了實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠模型。而β-隱黃素治療組與牙周炎組相比，結(jié)締組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目以及結(jié)合上皮根方遷移的距離和牙槽骨吸收量均明顯減少，說明了β-隱黃素對(duì)減輕牙周支持組織的炎癥和破壞起一定的積極作用。

牙齦組織中各種成分變化是牙周病最直觀的表現(xiàn)[9]。此外，外周血中氧化標(biāo)志物的變化可以反映牙周組織的局部炎癥與全身氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)系[10]。本實(shí)驗(yàn)從大鼠牙齦組織和外周血中檢測(cè)和比較MDA含量以及SOD、GSH-Px的活性。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，牙周炎組大鼠的牙齦組織和血清中的MDA含量明顯增高，而SOD和GSH-Px的活性明顯降低，表明大鼠牙周組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著，同時(shí)也與全身氧化應(yīng)激狀態(tài)密切相關(guān)，與研究[11-12]報(bào)道的結(jié)果相一致。這是由于炎癥細(xì)胞產(chǎn)生過量的氧自由基，而消除氧自由基的固有氧化劑含量不足引起的。給予β-隱黃素后顯示，與牙周炎組比較，用藥組牙齦組織和血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量降低，表明了外源性補(bǔ)充β-隱黃素可以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)牙周組織起到保護(hù)作用。

此外，Matsumoto et al[6]研究發(fā)現(xiàn)，β-隱黃素可以抑制LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成以及大鼠牙槽骨吸收。Nishigaki et al[3]體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-隱黃素可以抑制人牙周膜細(xì)胞對(duì)機(jī)械應(yīng)力和牙周致病菌共同誘導(dǎo)的IL-6和IL-8的表達(dá)并上調(diào)OPG的產(chǎn)生。課題組前期研究[13]顯示，給予β-隱黃素治療的牙周炎大鼠牙周組織內(nèi)成熟的破骨細(xì)胞數(shù)目明顯少于牙周炎組，RANKL/OPG的比值下調(diào)。這一系列的細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)β-隱黃素可以通過抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和破骨細(xì)胞的形成來減輕牙周病變組織的炎癥和骨喪失。

綜上所述，β-隱黃素具有良好的抗炎和抗氧化作用，在牙周炎的防治中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但目前關(guān)于β-隱黃素在牙周炎中具體作用機(jī)制的研究尚不全面，以及β-隱黃素的用藥劑量、給藥途徑和時(shí)間也不明確，需要大量的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探索。