王 雪，余 沛，王 怡，周 青，汪 淵，朱華慶

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種由于脂質(zhì)沉積于動(dòng)脈管腔，阻礙血液的供應(yīng)進(jìn)而出現(xiàn)一系列癥狀的疾病，復(fù)雜性和慢性進(jìn)行性是其最主要的特點(diǎn)，對(duì)人民健康危害甚大。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是一種鈣調(diào)素依賴酶，通過(guò)磷酸化肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)增強(qiáng)血管內(nèi)皮的收縮及張力，進(jìn)而增強(qiáng)血管內(nèi)皮的通透性，導(dǎo)致脂質(zhì)更加易于透過(guò)血管內(nèi)皮并且附著在血管內(nèi)皮，逐漸形成粥樣斑塊，血管管腔變窄[1]。全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)是維生素 A 的一種衍生物，研究[2]顯示ATRA可以改善內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、炎癥浸潤(rùn)等多種作用。該研究通過(guò)喂養(yǎng)高脂飼料復(fù)制AS兔模型，提取心臟組織并且體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，研究ATRA是否通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路調(diào)控心臟中MLCK的表達(dá)，為進(jìn)一步探究AS發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)并且為臨床治療AS提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑普通雄性新西蘭大白兔，體質(zhì)量(1.8±0.2)kg，購(gòu)自山東青島康大集團(tuán)；普通飼料購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；H9c2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基干粉購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；棕櫚酸及ERK/MAPK選擇性抑制劑PD98059購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ATRA購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所；膽固醇購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司(AR級(jí))；ERK、p-ERK、MLCK、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；HE染色試劑盒和BCA定量試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；Masson染色試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；免疫組化試劑盒購(gòu)和二抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2主要儀器與設(shè)備制冰機(jī)(AF100，意大利SCOTSMAN公司)；酶標(biāo)儀(Thermo MultiskanGO，美國(guó)Thermo-Fisher公司)；石蠟切片機(jī)(YT-7C型，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；正置式生物顯微鏡(DM4000B，德國(guó)Leica公司)；CO2培養(yǎng)箱(MCO-20AIC，日本Panasonic公司)，電泳儀(DYY-11型，北京六一儀器廠)；轉(zhuǎn)移電泳槽(DYY-Ⅲ408)；搖床(TS-1型，海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3方法

1.3.1模型的建立 普通級(jí)雄性新西蘭大白兔共24只，通過(guò)10 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將其隨機(jī)分為3組。正常組用普通飼料喂養(yǎng)；模型組用普通飼料、1%膽固醇和5%豬油喂養(yǎng)；ATRA組在用普通飼料、1%膽固醇和5%豬油喂養(yǎng)的同時(shí)給予ATRA灌胃治療5 mg/(kg·d)，12周以后，所有動(dòng)物全部處死。

1.3.2H9c2細(xì)胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇H9c2細(xì)胞，在37 ℃和5%CO2條件下用細(xì)胞瓶培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%左右，模型組、ATRA組及PD組給予棕櫚酸(10 μmol/L)刺激，6 h后ATRA組給予ATRA(10 μmol/L)；PD組給予PD98059(40 μmol/L)，12 h后提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot分析。

1.3.3標(biāo)本的制備 3%戊巴比妥將所有動(dòng)物麻醉，腹部解剖，取出心臟，將用PBS漂洗好的心臟組織用10%福爾馬林溶液固定，隨后用石蠟進(jìn)行包埋，切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、Masson染色及HE染色；剩余心臟組織放入-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4油紅染色 采用油紅O粉配制油紅O工作液，將動(dòng)脈壁縱向切開(kāi)后整體放入油紅O工作液液中浸泡3 min,隨后用60%乙醇調(diào)色，蘇木精用于復(fù)染，復(fù)染完成后鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗，保存在甲醛溶液中。

1.3.5HE染色 采用石蠟切片機(jī)切片，厚度為5 μm，切片脫蠟，梯度至水，蘇木精染色，自來(lái)水沖洗，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，自來(lái)水沖洗，脫水透明，中性樹(shù)脂封片，鏡下觀察。

1.3.6Masson染色 采用石蠟切片機(jī)切片，厚度為5 μm，切片脫蠟，梯度至水，核染液染1 min，沖洗液沖洗，漿染液染40 s，沖洗液沖洗，分色液分色8 min，傾去勿洗，復(fù)染液復(fù)染5 min，無(wú)水乙醇沖洗，中性樹(shù)脂封片，鏡下觀察。

1.3.7免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MLCK的表達(dá) 采用石蠟切片機(jī)切片，厚度為5 μm，切片脫蠟至水；枸櫞酸緩沖液煮沸至95 ℃，將切片放入枸櫞酸緩沖液煮沸15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻到室溫，滴加3% 過(guò)氧化氫去離子水孵育 10 min，TBS沖洗3遍；滴加一抗，室溫孵育2 h或者4 ℃過(guò)夜，TBS 沖洗3遍； 滴加聚合物輔助劑，室溫孵育10 min，TBS沖洗3遍；滴加二抗，室溫孵育 15 min，TBS沖洗3遍，滴加DAB顯色，自來(lái)水沖洗、蘇木精復(fù)染、梯度脫水、中性樹(shù)脂封片，鏡下觀察。

1.3.8Western blot 法檢測(cè) 稱取100 mg心臟組織，PBS洗去血漬，用濾紙將組織上殘留的PBS吸干后，放進(jìn)研磨器，加入1 ml裂解液，于冰上充分研磨成勻漿，研磨完成后，將勻漿吸入EP管中，-80 ℃、4 ℃中反復(fù)凍融3次后保存在-80 ℃中。將經(jīng)12 h處理好的細(xì)胞用PBS洗3遍，加入200 μl裂解液，冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞蛋白刮下，將蛋白液吸入EP管中。4 ℃、14 000 r/min離心30 min，棄去組織沉淀及細(xì)胞沉淀，吸取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度并用生理鹽水配置成同體積同濃度蛋白液，加入蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸變性，放于-80 ℃保存。配制SDS-PAGE凝膠，各組等量上樣電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移入PVDF膜。5%脫脂牛奶(TBST溶)室溫封閉2 h后TBST搖床洗一遍，TBS洗一遍，進(jìn)行一抗(GAPDH、ERK、p-ERK、MLCK)4 ℃ 孵育，一抗孵育完成后TBST搖床洗3遍，TBS洗一遍，于37 ℃二抗孵育2 h ，二抗孵育結(jié)束后，TBST搖床洗3遍，TBS洗一遍，于暗室滴加ECL發(fā)光劑，觀察熒光結(jié)果，并覆蓋X膠片顯影。膠片用掃描儀掃描后用QuantityOne軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH為參照，計(jì)算ERK、p-ERK、MLCK的相對(duì)灰度值。

2 結(jié)果

2.1油紅染色結(jié)果正常組動(dòng)脈壁光滑并且無(wú)明顯斑塊，而模型組出現(xiàn)大量斑塊，結(jié)果顯示造模成功(圖1)。

圖1 動(dòng)脈油紅染色結(jié)果A：正常組；B：模型組

2.2HE染色結(jié)果正常組心肌組織排列規(guī)則有序，給予高脂飼料后，心肌組織排列出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂且細(xì)胞核排列雜亂無(wú)章；給予ATRA后，相比模型組，心肌組織排列較整齊 (圖2)。

2.3Masson染色結(jié)果正常組無(wú)明顯膠原纖維堆積，模型組膠原纖維堆積程度升高，與模型組比較，ATRA組心肌膠原纖維堆積明顯減少 (圖3)。

2.4免疫組化結(jié)果模型組MLCK表達(dá)量明顯高于正常組，ATRA組相對(duì)于模型組而言，MLCK表達(dá)量有所降低 (圖4)。

2.5Westernblot結(jié)果與正常組比較，給予高脂飼料12周以后，MAPK通路相關(guān)蛋白ERK的磷酸化水平明顯升高，給予ATAR以后，ERK的磷酸化程度降低(F=62.464)(圖5)。與正常組比較，模型組MLCK表達(dá)增加，給予ATRA 以后，MLCK表達(dá)顯著降低(F=246.168)(圖6)。與正常組比較，給予棕櫚酸刺激后，MLCK表達(dá)水平升高；與模型組比較，經(jīng)ATRA給藥及PD98059后，MLCK表達(dá)水平顯著降低(F=134.130)(圖7)。

3 討論

隨著人們生活水平的提高和飲食的多樣化，AS引起的死亡已成為當(dāng)今人口死亡的主要原因，并愈發(fā)趨向年輕化。目前AS最主要的治療手段是靠他汀類和血管緊張素抑制劑類等藥物緩解[3]，但是AS發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性與多樣性，他汀類和血管緊張素抑制劑尚不能起到有效的治療，多數(shù)AS患者仍舊遭受疾病的折磨。近年來(lái)，相關(guān)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)多集中在動(dòng)脈內(nèi)皮，然而在相關(guān)的死亡調(diào)查中發(fā)現(xiàn)70%與心臟受損有關(guān)。心臟是人體中非常重要的一個(gè)器官，是人體中各個(gè)器官、組織的血流量的來(lái)源，其形態(tài)和功能的完整性對(duì)于機(jī)體進(jìn)行正常的生命活動(dòng)和維持正常的生理功能起著至關(guān)重要的作用。

AS極易引發(fā)多種心血管疾病如心絞痛、心力衰竭等從而降低心臟的順應(yīng)性；心臟缺血，影響心臟收縮功能，導(dǎo)致機(jī)體各組織和器官無(wú)法正常工作，最終導(dǎo)致死亡[4]。因此采取相應(yīng)預(yù)防措施，減輕心臟受損很有必要。

圖2 各組兔心肌形態(tài)變化 HE×400A：正常組；B：模型組；C：ATRA組

圖3 各組兔心肌膠原纖維的變化 Masson×400A：正常組；B：模型組；C：ATRA組

圖4 各組兔心肌的免疫組織化學(xué)染色 ×400A：正常組；B：模型組；C：ATRA組

圖5 ATRA對(duì)MAPK 途徑中ERK磷酸化的影響

A：正常組；B：模型組；C：ATRA組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖6 ATRA對(duì)MLCK蛋白表達(dá)的影響

A：正常組；B：模型組；C：ATRA組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖7 PD98059對(duì)MLCK蛋白表達(dá)的影響

A：正常組；B：模型組；C：ATRA組；D：PD組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

MLCK是一種存在于哺乳動(dòng)物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與許多重要的生命活動(dòng)，主要由MLCK1基因和MLCK2基因編碼[5]，MLCK2因編碼產(chǎn)物大多分布在橫紋肌細(xì)胞而MLCK1基因編碼產(chǎn)物在許多組織如骨骼肌、心肌中均表達(dá)[6]。MLCK主要通過(guò)磷酸化平滑肌和非平滑肌的肌球蛋白進(jìn)而調(diào)控肌球蛋白與肌球蛋白之間的細(xì)胞黏附、神經(jīng)突起生長(zhǎng)及內(nèi)皮細(xì)胞和上皮障礙的形成等一系列骨架活動(dòng)，對(duì)肌肉收縮產(chǎn)生重要影響[7-9]。研究[10-12]顯示高血脂、高血糖和高血壓均會(huì)引起MLCK發(fā)生不同程度的表達(dá)，并且MLCK的不同程度表達(dá)對(duì)心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生不同的影響。本研究中免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組MLCK蛋白的表達(dá)量明顯高于正常組，給予ATRA后表達(dá)量明顯下降。因此推測(cè)AS心肌損傷與MLCK的表達(dá)有關(guān)。

ATRA是維生素A在體內(nèi)經(jīng)兩步代謝而來(lái)的產(chǎn)物，臨床主要用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病[13]，近年研究[14]顯示ATRA灌胃后能減輕內(nèi)膜增厚和平滑肌細(xì)胞增生，在肥胖和AS及其并發(fā)癥防治方面的作用被越來(lái)越多的相關(guān)專業(yè)關(guān)注。本研究HE染色和Masson染色結(jié)果顯示模型組心肌纖維發(fā)生一定程度的紊亂與堆積，給予ATRA后，紊亂與堆積程度減輕，表明ATRA可以減輕AS兔心肌損傷情況。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs) 是一種將信號(hào)從細(xì)胞外傳到細(xì)胞核的并引起一些列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的重要信號(hào)調(diào)節(jié)酶。MAPK信號(hào)通路主要是由ERK、JNK、p38介導(dǎo)的三條級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與多種細(xì)胞反應(yīng)及機(jī)體多種生理病理過(guò)程[15]。研究[16]表明MAPK信號(hào)通路受到多種刺激發(fā)生級(jí)聯(lián)磷酸化被激活，促進(jìn)細(xì)胞因子的生成導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。AS的發(fā)病原因復(fù)雜多樣，目前沒(méi)有確切的說(shuō)法，但是炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激一直是導(dǎo)致AS發(fā)生的關(guān)鍵原因，因此，MAPK信號(hào)通路與AS的發(fā)生發(fā)展密切相連。Benson et al[17]發(fā)現(xiàn)ATRA可以通過(guò)MAPK通路途徑抑制血管平滑肌的增生從而有助于AS的防治。ERK主要參與生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，而且ERK部分參與心肌細(xì)胞基因的表達(dá)，是一條經(jīng)典的MAPK信號(hào)通路。所以推測(cè)ATRA是通過(guò)ERK/MAPK通路調(diào)控MLCK的表達(dá)。Western blot結(jié)果表明在給予高脂飼料喂養(yǎng)后，ERK磷酸化水平和MLCK的表達(dá)呈現(xiàn)一致性，均發(fā)生升高，給予ATRA治療后，磷酸化程度和MLCK的表達(dá)水平同時(shí)都發(fā)生降低。并且，HE染色和Masson染色結(jié)果均顯示給予ATRA治療后，心肌損傷程度減輕,免疫組化結(jié)果顯示ATRA組心肌中MLCK表達(dá)量減少。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，本研究顯示ATRA能降低MLCK的表達(dá)可能是通過(guò)ERK/MAPK通路途徑進(jìn)行調(diào)控。至于是否通過(guò)其他途徑進(jìn)行調(diào)控需要進(jìn)一步研究，而ATRA是否可以作為臨床抗AS藥物，明確其作用機(jī)制有待深入的探討。