張 俊， 周芳芳， 徐 瑋， 王 蕾

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200232；2.上海市第八人民醫(yī)院，上海 200233；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，上海 200025）

近年來(lái)，慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）在全球范圍的發(fā)病率呈迅速增長(zhǎng)趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)顯示CKD患者數(shù)已占到人口總數(shù)的4.3%～7.0%[1-3]，其中有58.7%～89.7%的CKD患者是通過(guò)篩查發(fā)現(xiàn)的。尿蛋白是臨床用于CKD篩查、診斷及治療監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。目前常用的篩查方法為尿干化學(xué)法，該法操作簡(jiǎn)單，可快速獲得結(jié)果，但干擾因素較多。本研究針對(duì)尿蛋白干化學(xué)法檢測(cè)的干擾因素設(shè)計(jì)模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，評(píng)估尿蛋白干化學(xué)法出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的原因。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2011年12月—2012年5月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院門診及住院患者新鮮隨機(jī)尿液標(biāo)本2 500份（門診患者標(biāo)本1 300份，住院患者標(biāo)本1 200份），及時(shí)檢測(cè)，同時(shí)查閱并記錄患者相關(guān)病史信息。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白定性檢測(cè) （1）尿干化學(xué)法：H-800全自動(dòng)尿液分析儀（長(zhǎng)春迪瑞公司）及配套試紙條。（2）磺基水楊酸法：在尿液標(biāo)本中分別滴加1～2滴200 g/L磺基水楊酸溶液（安徽弘慈公司），肉眼觀察結(jié)果，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）。

1.2.2 尿蛋白定量檢測(cè) 當(dāng)2種定性檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果不一致時(shí)，采用比色法定量檢測(cè)尿蛋白，將定量檢測(cè)結(jié)果作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)儀器為Modular P800全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司），試劑由英國(guó)朗道公司提供。

1.2.3 潛血模擬實(shí)驗(yàn) 配制紅細(xì)胞懸液，加入體檢健康者尿液（尿蛋白陰性）中以模擬“紅細(xì)胞尿”標(biāo)本，依次對(duì)倍稀釋，然后進(jìn)行尿常規(guī)分析。

1.2.4 尿液放置4 h后pH值對(duì)干化學(xué)法檢測(cè)尿蛋白的影響 （1）74份經(jīng)測(cè)定pH值正常（5.5～6.5）但尿蛋白檢測(cè)結(jié)果不同（包括陰性和陽(yáng)性）的標(biāo)本放置4 h后用干化學(xué)法檢測(cè)尿蛋白；（2）將放置4 h后pH值改變的標(biāo)本通過(guò)滴加弱酸（醋酸）調(diào)整pH值，恢復(fù)至正常范圍（5.5～6.5）后再次測(cè)定尿蛋白，對(duì)照pH值調(diào)整前后的測(cè)定值，以排除放置時(shí)間對(duì)pH值的干擾。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，方法學(xué)的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干化學(xué)法與磺基水楊酸法尿蛋白檢測(cè)結(jié)果的比較

在2 500份隨機(jī)尿標(biāo)本中，2種方法結(jié)果一致（包括相差一級(jí)）的有2 391份（95.64%），結(jié)果不一致的有109份（4.36%）。在836份尿蛋白陽(yáng)性標(biāo)本中，有19份干化學(xué)法陽(yáng)性（1+～3+）、磺基水楊酸法陰性；有66份干化學(xué)法陰性、磺基水楊酸法陽(yáng)性（1+～3+），見(jiàn)表1。2種方法的檢測(cè)結(jié)果之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2 021.51，P＜0.001）。

表1 干化學(xué)法與磺基水楊酸法尿蛋白檢測(cè)結(jié)果的比較

2.2 干化學(xué)法出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的影響因素分析

對(duì)19份干化學(xué)法陽(yáng)性（1+及以上）而磺基水楊酸法陰性的標(biāo)本進(jìn)行尿蛋白定量檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性，由此判定干化學(xué)法在檢測(cè)這19份標(biāo)本時(shí)出現(xiàn)了假陽(yáng)性。對(duì)這19份尿標(biāo)本的其他常規(guī)項(xiàng)目異常檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分類，其中潛血陽(yáng)性13例（68%）、膽紅素陽(yáng)性1例（1.5%）、pH值＞6.5 5例（26.3%）、比重≥1.03 6例（31.6%）、尿沉渣紅細(xì)胞增多7例（36.8%）。

2.3 潛血陽(yáng)性（紅細(xì)胞）對(duì)干化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果的影響

當(dāng)尿液中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1×105時(shí)，尿蛋白陰性的標(biāo)本干化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。見(jiàn)表2。

2.4 放置4 h后尿液pH值的改變對(duì)干化學(xué)法尿蛋白檢測(cè)結(jié)果的影響

將74份pH值正常（5.5～6.5）但尿蛋白檢測(cè)結(jié)果不同（陰性、±和1+）的標(biāo)本放置4 h，所有標(biāo)本的pH值均＞7.0。采用干化學(xué)法檢測(cè)這74份標(biāo)本的尿蛋白，有54份（72.97%）標(biāo)本的尿蛋白結(jié)果出現(xiàn)變化。21份pH值為7.0～8.5的尿液標(biāo)本，其尿蛋白結(jié)果的陽(yáng)性程度均高于4 h前的測(cè)定值，出現(xiàn)了假陽(yáng)性。32份pH值≥8.5的標(biāo)本中有15份出現(xiàn)了假陰性，17份陽(yáng)性標(biāo)本中有5份標(biāo)本出現(xiàn)了假陰性。

將54份出現(xiàn)結(jié)果改變的標(biāo)本通過(guò)滴加弱酸（醋酸）的方式調(diào)整pH值至正常范圍（5.5～6.5），發(fā)現(xiàn)其中40份尿液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果與初始結(jié)果一致。見(jiàn)表3。

表2 紅細(xì)胞（不溶血）對(duì)尿蛋白結(jié)果的影響

表3 pH值對(duì)干化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果的影響

3 討論

尿常規(guī)是臨床上最常用的檢驗(yàn)項(xiàng)目之一。正常人尿常規(guī)中的尿蛋白檢測(cè)結(jié)果為陰性，當(dāng)腎臟出現(xiàn)腎小球、腎小管疾病時(shí)，尿蛋白常呈持續(xù)異常升高。目前臨床常用的定性檢測(cè)尿蛋白的方法為干化學(xué)法。此法操作簡(jiǎn)便、快捷，但影響結(jié)果的因素較多。因此，本研究針對(duì)可能影響尿蛋白干化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果的因素設(shè)計(jì)模擬分析，深入探討尿蛋白干化學(xué)法的影響因素。

本研究同時(shí)采用干化學(xué)法與磺基水楊酸法檢測(cè)2 500份尿液標(biāo)本，2種方法檢測(cè)結(jié)果差異較大（P＜0.001），結(jié)果一致（包括相差一級(jí)）的有2 391份（95.64%），結(jié)果不一致的有109份（4.36%）。干化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果為陰性而磺基水楊酸法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（1+～3+）的標(biāo)本有66份。造成這種差異的原因可能與干化學(xué)法檢測(cè)原理的局限性有關(guān)。干化學(xué)法利用指示劑誤差原理[5]，以溴酚藍(lán)為指示劑，其顏色的變化與結(jié)合的蛋白的量成正比，但溴酚藍(lán)主要對(duì)白蛋白敏感，對(duì)球蛋白、低相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)及免疫球蛋白輕鏈不敏感。而磺基水楊酸法不僅僅可以檢測(cè)白蛋白，也能檢測(cè)球蛋白、本周蛋白。有研究結(jié)果顯示，干化學(xué)法主要檢測(cè)尿液中的白蛋白，對(duì)于球蛋白等其他蛋白成分的敏感性較差，基本不與這些蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；當(dāng)尿中球蛋白 ＜4 000 mg/L時(shí)干化學(xué)法尿蛋白結(jié)果為陰性，只有當(dāng)球蛋白達(dá)到5 500 mg/L時(shí)才出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)于白蛋白/球蛋白比值為1∶2的蛋白尿，蛋白濃度高達(dá)2 000 mg/L時(shí)才會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，測(cè)定球蛋白的敏感性僅為白蛋白的1/100～1/50[6]。對(duì)于低相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白尿或溢出性蛋白尿，干化學(xué)法多呈假陰性反應(yīng)[7]。有研究結(jié)果顯示，當(dāng)大劑量青霉素靜脈注射患者尿液中青霉素＞40 000 U/mL時(shí)，干化學(xué)法測(cè)定尿蛋白出現(xiàn)假陰性，而磺基水楊酸法出現(xiàn)假陽(yáng)性[8]。出現(xiàn)此結(jié)果差異的主要原因是由于2種方法的反應(yīng)原理不同。青霉素是一種有機(jī)弱酸，進(jìn)入機(jī)體后，可以釋放H+，改變環(huán)境的pH值，當(dāng)用磺基水楊酸法檢測(cè)尿蛋白時(shí)，外界環(huán)境的pH值低于等電點(diǎn)，促使尿液中蛋白質(zhì)與磺基水楊酸更容易反應(yīng)，增加沉淀物的析出。青霉素本身有類似蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的肽鍵，可與磺基水楊酸結(jié)合，產(chǎn)生沉淀。2種因素增加了沉淀物的析出，使磺基水楊酸法檢測(cè)結(jié)果為假陽(yáng)性或陽(yáng)性程度高于干化學(xué)法。而當(dāng)用干化學(xué)法檢測(cè)尿蛋白時(shí)，酸堿指示劑產(chǎn)生陰離子與帶陽(yáng)離子的蛋白質(zhì)結(jié)合生成復(fù)合物，但青霉素降低了環(huán)境的pH值，沒(méi)有達(dá)到酸堿指示劑的緩沖范圍，無(wú)法使指示劑發(fā)生顏色改變，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果為假陰性。

本研究設(shè)計(jì)了模擬實(shí)驗(yàn)分析造成干化學(xué)法假陽(yáng)性結(jié)果的影響因素。結(jié)果顯示當(dāng)尿液中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1×105時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因此對(duì)于紅細(xì)胞顯著增多的不溶血的尿標(biāo)本，尤其是肉眼血尿標(biāo)本，當(dāng)?shù)鞍锥ㄐ詸z測(cè)為陽(yáng)性時(shí)不應(yīng)盲目地根據(jù)尿蛋白定性結(jié)果判斷腎臟損傷程度，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行尿沉渣鏡檢、尿蛋白定量檢測(cè)或其他檢查加以輔助診斷[9]。此外，pH值對(duì)尿蛋白也有很大的影響，長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)使尿液標(biāo)本的pH值發(fā)生改變[10]。當(dāng)尿液為堿性時(shí)，尿蛋白檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)pH值為7.0～8.5時(shí)干化學(xué)法易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而當(dāng)pH值≥8.5時(shí)則可能出現(xiàn)假陰性。上述結(jié)果表明堿性尿?qū)Ω苫瘜W(xué)法有明顯的影響。這是由于該方法的“指示劑蛋白誤差原理”需在恒定的酸性條件下進(jìn)行，而堿性尿會(huì)改變pH值的緩沖環(huán)境，使檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性。當(dāng)pH值≥8.5時(shí)出現(xiàn)假陰性的原因可能是由于在該pH值的條件下已超過(guò)了干化學(xué)法指示劑的緩沖范圍，導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)生顯色反應(yīng)所致。一些藥物如奎寧、奎寧丁和嘧啶等均會(huì)使尿液呈強(qiáng)堿性（pH值≥9.0），導(dǎo)致干化學(xué)法尿蛋白檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

綜上所述，尿液中紅細(xì)胞的存在、pH值過(guò)高或過(guò)低以及藥物等影響都可能使干化學(xué)法出現(xiàn)與實(shí)際不符的結(jié)果。臨床上應(yīng)對(duì)尿蛋白結(jié)果綜合進(jìn)行分析，以免造成漏檢和誤診。