劉冀川

（四川省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041）

肝臟擁有包括肝動(dòng)脈與肝門(mén)靜脈的豐富血液供應(yīng)，且與腸道聯(lián)系緊密，肝門(mén)靜脈接收的血液主要是來(lái)自腸道中靜脈血液的匯入，而形成了一種肝-腸循環(huán)軸[1]。近年來(lái)對(duì)肝-腸循環(huán)軸的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)的變化與慢性肝功能損傷有著密不可分的關(guān)系[2]。肝硬化是一種臨床上常見(jiàn)的慢性肝病，呈進(jìn)行性發(fā)展，發(fā)展至終末期時(shí)可出現(xiàn)多種不同程度的并發(fā)癥，包括肝性腦病（hepatic encephalopathy，HE）[3]。HE是肝硬化最嚴(yán)重的一種并發(fā)癥，但目前尚不清楚腸道微生態(tài)在慢性HE發(fā)病中的確切機(jī)制。肝硬化發(fā)展至一定程度時(shí)出現(xiàn)的腸道微生態(tài)失衡或移位可促進(jìn)機(jī)體炎性反應(yīng)的產(chǎn)生[4]，然而目前尚不清楚慢性肝硬化失代償期HE與血清炎性因子變化及腸道微生態(tài)的關(guān)系。因此，本研究探討了慢性肝硬化并發(fā)HE患者腸道常見(jiàn)細(xì)菌與血清炎性因子[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23]變化的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

從2015年8月—2017年2月在四川省腫瘤醫(yī)院住院的慢性乙型肝炎肝硬化肝功能失代償期的患者中篩選出并發(fā)HE的患者120例（HE組），其中臨床分期Ⅰ期36例、Ⅱ期50例、Ⅲ期31例、Ⅳ期3例。另選取未并發(fā)HE的慢性乙型肝炎肝硬化患者100例（對(duì)照組）。記錄所有患者的年齡、性別、肝功能指標(biāo)[血清白蛋白（albumin，Alb）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TB）和凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）]變化及肝功能Child分級(jí)情況，同時(shí)測(cè)量所有患者糞便（成形）濕重。所有患者均知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合乙型肝炎后肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：有乙型肝炎病史、存在慢性肝炎肝硬化失代償期的臨床癥狀和體征、乙型肝炎表面抗原標(biāo)志物血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性超過(guò)半年、已出現(xiàn)肝功能異常，腹部B超和計(jì)算機(jī)斷層掃描等影像學(xué)檢查明確診斷為肝硬化失代償期；（2）HE的診斷是在肝硬化失代償期診斷的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了以代謝紊亂為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)的癥狀，表現(xiàn)為不同程度的意識(shí)障礙、空間定向力減弱、行為異常和神志昏迷；（3）入組前2周內(nèi)未進(jìn)行任何抗病毒藥物及保肝治療、未服用微生物制劑及抗菌藥物。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）心、肺、腎功能?chē)?yán)重不全；（2）由其他原因引起的肝損傷；（3）其他部位有感染征象；（4）糖尿病以及上消化道大出血；（5）使用糖皮質(zhì)激素及抗精神病類(lèi)藥物；（6）長(zhǎng)期酗酒并患有各類(lèi)精神、神經(jīng)疾?。唬?）存在胃腸道創(chuàng)傷或有外科手術(shù)史。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 腸道微生態(tài)變化 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)所有患者腸道中12種常見(jiàn)細(xì)菌的分布情況。收集患者晨起經(jīng)隱血實(shí)驗(yàn)證實(shí)為陰性且未受尿液污染的尾便，置無(wú)菌樣本收集器中，攪勻后稱(chēng)重，取200 mg分裝于無(wú)菌Eppendorf管，-80 ℃保存?zhèn)溆?。統(tǒng)一進(jìn)行糞便總DNA提取和PCR。各類(lèi)細(xì)菌的引物序列參照GenBank（https：//en.wikipedia.org/wiki/Gene_bank）進(jìn)行合成，本研究設(shè)計(jì)的細(xì)菌引物序列見(jiàn)表1。PCR后再進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，最后將定量檢測(cè)到的糞便DNA拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值并進(jìn)行分析。采用細(xì)菌16S rRNA作為內(nèi)參基因。

1.3.2 血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10檢測(cè) 采用無(wú)菌管采集所有患者清晨空腹全血5 mL，靜置30 min，278×g離心5 min，取上清，分裝于無(wú)菌Eppendorf管中進(jìn)行血清炎性因子的檢測(cè)或置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。血清TNF-α、IL-12、IL-6和IL-10采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自武漢碧云天有限公司，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量指標(biāo)之間的相關(guān)性分析采用Pearson直線(xiàn)相關(guān)分析；肝功能Child分級(jí)與菌落或血清炎性標(biāo)志物之間的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 細(xì)菌引物序列

2 結(jié)果

2.1 HE組與對(duì)照組基本情況及肝功能指標(biāo)比較

HE組與對(duì)照組之間一般指標(biāo)、糞便濕重及PT差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但血清Alb、ALT、AST、TB以及肝功能Child分級(jí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 HE組與對(duì)照組腸道細(xì)菌種類(lèi)比較

與對(duì)照組比較，HE組顯著增殖的腸道細(xì)菌有腸致病性大腸埃希菌、假單胞菌屬、腸球菌屬、普雷沃登菌屬、葡萄球菌屬、梭菌屬和白念珠菌（P＜0.05）。顯著減少的細(xì)菌有雙歧桿菌、鏈球菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌和瘤胃球菌屬。除鏈球菌屬和擬桿菌屬外，其他細(xì)菌差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 HE組與對(duì)照組血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比較

HE組血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.001）。見(jiàn)表4。

2.4 HE組與對(duì)照組腸道細(xì)菌與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

HE組腸道中致病性大腸埃希菌與Alb呈負(fù)相關(guān)，與ALT、AST及肝功能Child分級(jí)呈正相關(guān)，鏈球菌屬與TB及PT呈正相關(guān)，假單胞菌屬與Alb、TB及肝功能Child分級(jí)呈正相關(guān)，普雷沃登菌屬與ALT呈負(fù)相關(guān)，乳酸桿菌與Alb、ALT及AST呈正相關(guān)，瘤胃球菌屬與Alb、ALT及肝功能Child分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，梭菌屬與ALT及TB呈負(fù)相關(guān)。對(duì)照組中只有致病性大腸埃希菌與肝功能指標(biāo)相關(guān)。見(jiàn)表5、表6。

2.5 HE組與對(duì)照組腸道細(xì)菌與血清炎性因子的相關(guān)性分析

HE組致病性大腸埃希菌與IL-12、IL-10和IL-23呈正相關(guān)；雙歧桿菌與TNF-α和IL-23呈負(fù)相關(guān)，與IL-12和IL-1β呈正相關(guān)；鏈球菌屬與IL-10呈正相關(guān)；腸球菌屬與TNF-α、IL-10呈正相關(guān)，與IL-12呈負(fù)相關(guān)；擬桿菌屬與TNF-α、IL-10及IL-23呈正相關(guān)；普雷沃登菌屬與TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-23均呈正相關(guān)；乳酸桿菌與IL-6和IL-10呈負(fù)相關(guān)；瘤胃球菌屬與IL-12、IL-1β及IL-23呈負(fù)相關(guān)；梭菌屬與IL-12、IL-10呈正相關(guān)，與IL-6呈負(fù)相關(guān)。對(duì)照組中只有致病性大腸埃希菌與6種炎性因子相關(guān)。見(jiàn)表7、表8。

表2 HE組與對(duì)照組基本情況及肝功能指標(biāo)的比較

表3 HE組與對(duì)照組腸道常見(jiàn)細(xì)菌比較

表3 HE組與對(duì)照組腸道常見(jiàn)細(xì)菌比較

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表4 HE組與對(duì)照組血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比較 （pg/mL，

表4 HE組與對(duì)照組血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比較 （pg/mL，

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表5 HE組腸道細(xì)菌與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性

表6 對(duì)照組腸道細(xì)菌與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

表7 HE組腸道細(xì)菌與血清炎性因子的相關(guān)性

3 討論

人體腸道正常微生態(tài)的主要成分是專(zhuān)性厭氧菌，包括雙歧桿菌、球菌和乳酸桿菌，而其他的兼性需氧菌是指一類(lèi)無(wú)致病性的大腸埃希菌、鏈球菌和腸球菌，盡管這類(lèi)細(xì)菌在正常情況下對(duì)人體無(wú)害，但是當(dāng)腸道環(huán)境改變時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?011年，ARUMUGAM等[6]檢測(cè)了人體正常腸道中的厭氧菌宏基因組序列，結(jié)果顯示這些非隨機(jī)組合的腸道細(xì)菌可以大致分為擬桿菌屬、普雷沃登菌屬和瘤胃球菌屬，并且這些菌屬均與人的年齡、性別、人種、體重指數(shù)以及區(qū)域環(huán)境無(wú)關(guān)[6]。有研究結(jié)果顯示，在慢性乙型肝炎和由其所致的肝硬化患者中，存在著不同程度的腸道微生態(tài)失衡現(xiàn)象，而且菌屬的多樣性也較差[7]。

肝硬化發(fā)展至一定程度時(shí)，腸道微生態(tài)受到破壞，使腸道防御能力下降而導(dǎo)致微生態(tài)失衡或細(xì)菌移位，引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)免疫炎性反應(yīng)，釋放的一系列炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β、IL-23、IL-10等）產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8-9]，損傷機(jī)體重要臟器，其中就包括肝臟。本研究結(jié)果顯示，HE組肝功能異常程度明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而且上述6種炎性因子水平也要明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），表明肝功能異常程度可能與免疫炎性因子的異常表達(dá)有關(guān)。此外，因?yàn)楦喂δ苤笜?biāo)是對(duì)肝臟功能受損程度最直接的反映，且大多數(shù)HE患者腸道細(xì)菌與不同肝功能指標(biāo)存在不同程度的相關(guān)性，這意味著腸道微生態(tài)的失衡可能與HE的發(fā)生及病情進(jìn)展相關(guān)。然而腸道細(xì)菌的種類(lèi)與慢性肝病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系如何以及二者的相關(guān)作用機(jī)制目前尚不明確。本研究中結(jié)果顯示，HE患者腸道中的不同細(xì)菌出現(xiàn)顯著增殖或顯著減少，說(shuō)明肝硬化并發(fā)HE的患者腸道微生態(tài)嚴(yán)重失衡，這與文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]一致。腸道微生態(tài)有調(diào)節(jié)免疫炎性因子產(chǎn)生和釋放的作用。陳萌萌[12]的研究結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎及其所致肝硬化患者除腸道微生態(tài)失衡外，腸道細(xì)菌種類(lèi)還與多種炎性因子存在相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，大多數(shù)HE患者腸道細(xì)菌與TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β、IL-23、IL-10相關(guān)，而且相關(guān)的細(xì)菌種類(lèi)和程度均高于對(duì)照組，表明HE患者腸道中異常增殖的細(xì)菌產(chǎn)生了更多、范圍更廣的炎性反應(yīng)，激活了機(jī)體免疫炎性細(xì)胞。這些活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生了大量的細(xì)胞因子和炎性因子，從而加重了肝臟的炎性反應(yīng)和組織損傷[13-14]，進(jìn)一步使得肝功能減退，加重了HE病情。

綜上所述，腸道微生態(tài)失衡可能參與慢性乙型肝炎肝硬化并發(fā)HE發(fā)生、發(fā)展及肝功能損傷過(guò)程，并且多種免疫炎性因子產(chǎn)生和分泌的協(xié)同調(diào)控可能也與HE發(fā)展的病理機(jī)制相關(guān)。