戚應(yīng)杰，石玉如，劉 婷，岳 莉，趙長城，王 云，馬筱玲

（1. 安徽省立醫(yī)院感染病院檢驗科，安徽 合肥 230022；2. 安徽省立醫(yī)院，安徽 合肥 230022）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種傳染病，最常見的患病部位是肺部。2012年，全球約有860萬例結(jié)核新發(fā)病例，約130萬人死于結(jié)核病[1]，結(jié)核病已成為影響全球的重大公共衛(wèi)生問題。可靠、準確的檢測方法是結(jié)核病診斷和治療的關(guān)鍵。目前，MTB培養(yǎng)或影像學檢查仍是診斷結(jié)核病的金標準。MTB特異性分泌蛋白的抗體檢測對結(jié)核病的診斷具有重要的意義。利用基因工程技術(shù)將MTB的特異性分泌蛋白制成融合蛋白，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中的特異性抗體對于結(jié)核病的診斷有重要的臨床意義[2]。但有研究結(jié)果顯示，ELISA的結(jié)果易受實驗中多種因素和Cut-off值設(shè)定的影響，普遍存在準確性和重復性不高的缺點[3-5]。本研究擬建立抗結(jié)核分枝桿菌多表位融合抗原IgG抗體（anti-multi-epitope fusion antigen IgG antibody of Mycobacterium tuberculosis，MTB-Ab）檢測的最佳臨界值，并評價其在肺結(jié)核診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年5月—2016年12月安徽省立醫(yī)院感染病院結(jié)核科門診及住院的肺結(jié)核患者120例，其中活動性肺結(jié)核62例、非活動肺結(jié)核58例，診斷標準均符合2001年中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會制定的肺結(jié)核診斷標準。以同期安徽省立醫(yī)院感染病院168名體檢健康者作為正常對照組。各組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。所有患者甲、乙型肝炎病毒感染指標均為陰性，未合并其他急性感染性疾病。

1.2 方法

采集所有對象清晨空腹肘靜脈血4 mL，2 000×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存待測。檢測儀器為STAT FAX2100酶標儀（美國Awareness公司），MTB-Ab ELISA檢測試劑盒購自上海榮盛公司，嚴格按標準操作程序進行操作。試劑盒說明書建議的Cut-off值為陰性對照平均吸光度（A）值+0.12，取0.18。將樣本孔A值/Cut-off值定義為Cut-off值指數(shù)（cut-off index，COI）。室內(nèi)質(zhì)控在控后進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。分別以正常對照組和非活動性肺結(jié)核組為對照繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，使用Medcalc 15.10軟件確定最佳Cut-off值，計算最佳COI值，以此作為自建臨界值計算敏感性、特異性、約登指數(shù)、陽性似然比、陰性似然比、陽性預測值和陰性預測值，并與以試劑盒Cut-off值為臨界值得出的診斷性能進行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTB-Ab診斷肺結(jié)核的最佳COI值

以正常對照組為對照，MTB-Ab診斷肺結(jié)核的曲線下面積（area under curve，AUC）[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]為0.891（0.852～0.930），最佳COI值（COI1）為0.90，此時敏感性為92.50%，特異性為82.10%；以非活動性肺結(jié)核組為對照，MTBAb診斷活動性肺結(jié)核的AUC（95%CI）為0.721（0.632～0.799），最佳COI值（COI2）為3.65，此時敏感性為79.03%，特異性為62.07%。

圖1 MTB-Ab診斷肺結(jié)核的ROC曲線

2.2 肺結(jié)核組與正常對照組COI值比較

肺結(jié)核組COI值為4.57（1.15～6.85），明顯高于正常對照組[1.25（0.31～2.90）]（P＜0.05）。活動性肺結(jié)核組COI值為6.52（4.27～11.98），明顯高于非活動性肺結(jié)核組[3.12（2.35～5.02）]（P＜0.05）。見圖2。

圖2 正常對照組與肺結(jié)核組之間COI值的比較

2.3 不同臨界值的診斷性能比較

分別以試劑盒Cut-off值（0.18）、COI1（0.90）及COI2（3.65）作為診斷肺結(jié)核的臨界值，進行診斷性能評價。結(jié)果顯示，COI1的敏感性高于試劑盒Cut-off的敏感性（P＜0.05），特異性、約登指數(shù)、陽性似然比、陰性似然比、陽性預測值、陰性預測值二者之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；COI2的敏感性、特異性、約登指數(shù)、陽性似然比、陽性預測值、陰性預測值均顯著低于COI1（P＜0.05），而陰性似然比顯著高于COI1（P＜0.05）。見表1。

表1 不同臨界值下MTB-Ab診斷肺結(jié)核的性能評價

3 討論

雖然結(jié)核病的防控取得了一定的成效，但目前全球每年仍有大約150萬人死于結(jié)核病[6]。結(jié)核病防治面臨的挑戰(zhàn)是多方面的，包括獲得性免疫缺陷綜合征與結(jié)核病的雙重感染、缺乏有效的疫苗、不斷出現(xiàn)的耐多藥MTB[7]等，其中最重要的一點是沒有特異性的生物標志物，無法對結(jié)核病作出早期診斷[8-9]。結(jié)核病患者外周血MTB抗體的檢測具有簡便、快捷的特點，但因其抗原的特異性不高、干擾因素多和受Cut-off值設(shè)定等的影響，造成其診斷準確性不高[5]，不能作為單獨的診斷標準。目前的診斷試劑并不能滿足臨床需要，導致血清學診斷在結(jié)核病中的診斷價值一直存在爭議。

本研究采用的商品化試劑盒的成分為利用基因工程技術(shù)克隆表達的致病性MTB的7種結(jié)核特異性表位抗原，通過將7種特異性抗原（38 000、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3）優(yōu)勢肽段分別制備成融合抗原來提高抗原的特異性[10-12]。利用多表位MTB特異性融合抗原檢測MTB抗體成為近年來不少學者研究的熱點。血清學診斷在結(jié)核病中的診斷價值有望被重新挖掘。周鵬等[13]聯(lián)合MTB 7種特異性抗原檢測患者血清中的抗體，結(jié)果顯示多種抗原聯(lián)合檢測可提高MTB抗體檢測的敏感性，7種抗原在血清抗體檢測中具有抗原互補性，不同抗原與機體反應(yīng)存在不同的反應(yīng)模式。本研究同時使用全自動酶標儀、標準操作程序和最佳COI值來消除傳統(tǒng)方法檢測MTB抗體的影響[14]，并評價MTB-Ab診斷肺結(jié)核的價值。

本研究結(jié)果顯示，正常對照組與肺結(jié)核組之間、活動性肺結(jié)核與非活動性結(jié)核組之間COI值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ROC曲線分析顯示，MTB-Ab診斷肺結(jié)核的AUC（95%CI）為0.891（0.852～0.930），說明用MTB-Ab診斷MTB感染具有較高的準確性；以正常對照組為對照得出的最佳COI值（COI1）為0.90，此時敏感性為92.50%，特異性為82.10%。本研究進一步對2個臨界值的診斷性能進行了評價，結(jié)果顯示COI1的敏感性高于試劑盒Cut-off值（P＜0.05），說明通過ROC曲線確定最佳COI值比試劑盒Cutoあ值在結(jié)核病的診斷上更有價值。

本研究結(jié)果還顯示，以非活動性肺結(jié)核組為對照得出的最佳COI值（COI2）作為臨界值時，其主要性能指標（敏感性、特異性、約登指數(shù)、陽性似然比、陽性預測值、陰性預測值）與COI1比較均明顯降低，陰性似然比則明顯升高，說明對活動性肺結(jié)核的診斷性能反而下降了。由此可見，MTB-Ab檢測在鑒別診斷活動性肺結(jié)核與非活動性肺結(jié)核中不理想，還有待進一步改進。

綜上所述，MTB-Ab具有較高的臨床診斷價值，以最佳COI值作為臨界值可獲得最大診斷效能，可以為結(jié)核病的診斷提供依據(jù)。