沈連麗,莫如榮,張建華,張志杰,馬欣,魏道德
1.湖州市南潯區(qū)菱湖人民醫(yī)院藥劑科,浙江 湖州 313018
2.駐馬店魏道德骨科醫(yī)院風濕免疫科,河南 駐馬店 463000
腰椎間盤突出癥(Lumbar disc herniation,LDH)是臨床骨科的常見病,主要是在腰椎間盤退變的基礎上,外力因素導致纖維環(huán)破裂,髓核組織從破裂處突出甚至脫出,壓迫鄰近脊神經(jīng)根,產(chǎn)生腰腿疼痛、麻木等癥狀[1~3]?;|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)及其抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)在維持椎間盤細胞外基質(zhì)成分的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用,MMP是主要的基質(zhì)蛋白降解酶,其酶活性增強將造成基質(zhì)過度降解,導致椎間盤退變,而內(nèi)源性TIMP可直接抑制MMP活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)退變椎間盤中MMP含量升高,TIMP卻相對不足,這就造成椎間盤內(nèi)蛋白減少、基質(zhì)成分改變[5~6]。魏氏核歸丸是駐馬店魏道德骨科醫(yī)院長期臨床實踐總結的經(jīng)驗方,此方主治腰椎間盤突出癥,能消除腰椎炎癥,減輕水腫,使神經(jīng)壓迫癥狀得以緩解,進而起到行氣活血、祛風除濕、消炎止痛等功效,但其具體作用機理尚未闡明。故本研究通過建立LDH大鼠模型,探究魏氏核歸丸對LDH大鼠病變椎間盤組織MMP2、MMP9、TIMP1表達的影響,以期為臨床治療LDH提供指導。
1.1 實驗動物和分組 SPF級SD健康大鼠60只,體質(zhì)量180~220 g,雌雄不限,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物批號:SYXK(京)2017-0022。將大鼠隨機分為5組,每組12只,包括假手術組、模型組以及魏氏核歸丸低、中、高劑量組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)。
1.2 藥物 魏氏核歸丸來自駐馬店魏道德骨科醫(yī)院,由杜仲、炒菟絲子、酒當歸、狗脊各600 g,續(xù)斷、宣木瓜、獨活各300 g,土元、醋乳香、醋沒藥各250 g,香附、木香各150 g、骨碎補450 g、醋延胡索500 g、熟地黃900 g和制馬錢子82 g,共16味中藥組成。功效:補腎壯骨、滋肝養(yǎng)筋、行氣活血、祛風除濕、扶正祛邪;用法:1次9 g,1天3次,飯后服用。根據(jù)人鼠體表面積等效量法換算出200 g大鼠用藥劑量為1次162 mg,以此作為中劑量,設低、中、高劑量比例為1∶2∶4,即低劑量為81 mg,高劑量為324 mg。臨用時將藥丸用生理鹽水配成81、162、324 mg/mL的混懸液。
1.3 動物模型制備 10%水合氯醛按照0.5 mL/100 g腹腔麻醉,麻醉起效后右側臥位固定于手術臺,背毛消毒,正中切開鼠尾暴露椎間盤,連續(xù)勾出6個椎間盤,浸入無菌生理鹽水中,迅速縫合傷口。將1個椎間盤用生理鹽水稀釋后,攪拌成混懸液備用。于正中切開大鼠背部,暴露L4~L5橫突、刺突,顯微鏡下切開L5左側椎板,在神經(jīng)根和硬脊膜間置入自體尾椎椎間盤,同時將尾椎椎間盤稀釋液注入硬膜囊外與神經(jīng)根周緣,注意髓核接觸但未壓迫神經(jīng)根。甲硝唑沖洗后逐層縫合傷口。假手術組僅暴露神經(jīng)根后縫合傷口,其他操作同上。
1.4 給藥處理 造模后5天,每天注射青霉素8萬U/只預防感染,正常喂養(yǎng),至大鼠尾部結痂。造模5天后連續(xù)灌胃給藥14天,1天3次,每次低劑量組給予1 mL/200 g低濃度藥液(81 mg/mL);每次中劑量組給予1 mL/200 g中濃度藥液(162 mg/mL);每次高劑量組給予1 mL/200 g高濃度藥液(324 mg/mL);假手術組和模型組給予等量生理鹽水。每天8∶00、13∶30、19∶00各給藥1次。
1.5 行為學觀察 觀察大鼠有無煩躁不安(如撕咬肢體、不停舔后爪、后足或肢忽而自行抬起),飲食變化情況,運動功能是否異常,大小便是否失禁等。
1.6 后肢痛覺實驗 參照陸志東等[7]方法自制大鼠機械刺激縮爪閾值儀,由血壓計、5 mL注射器內(nèi)芯和磨禿的20 mL注射器針尖組裝而成。造模前1天、造模后5天、灌胃后7天和14天進行測量。測量時將大鼠放入塑料杯內(nèi),露出左后肢,大鼠平靜后將自制測量儀針頭置于左后爪4、5趾骨間,接著向血壓計充氣,大鼠出現(xiàn)尖叫或縮爪時停止,記錄血壓計讀數(shù),以此作為縮爪閾值,間隔20 min測1次,取3次測量值的平均數(shù)。假設造模前1天的縮爪域值為基礎域值,若高于此值則痛覺遲鈍,若低于此值則痛覺過敏。
1.7 蘇木精-伊紅(HE)染色 末次給藥結束后,各組隨機選取大鼠4只,收集腰部髓核,于4%多聚甲醛溶液中固定24~48 h;脫水后石蠟包埋;用組織切片機以10μm厚度切片,60℃恒溫箱中烤片3~5 h;切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化;蘇木精液染色5 min;水沖洗后75%鹽酸乙醇分化30 s;水沖洗、乙醇處理后酸化伊紅溶液染色2 min;乙醇脫水、二甲苯透明;用中性樹膠封片、烘烤過夜。在光鏡下觀察并拍照。
1.8 酶聯(lián)免疫(ELISA) 檢測 用ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測定各組大鼠腰部髓核中MMP2、MMP9、TIMP1含量。將髓核剪成碎片,加入適量標本稀釋液,漩渦勻漿。向反應板各孔加入100μL樣品,混勻后置于37℃恒溫箱中2 h;反應板洗滌并吸干后,加入100μL一抗工作液,混勻后置于37℃恒溫箱中1 h;反應板洗滌并吸干后,加入100μL酶標抗體工作液,置于37℃恒溫箱中0.5 h;反應板洗滌并吸干后,加入100μL終止液并混勻;0.5 h內(nèi)用酶標儀測定450 nm處吸光度。
1.9 統(tǒng)計學方法 用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料用(±s)表示,方差分析;計數(shù)資料用“率”描述,用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 造模后大鼠行為觀察 各組大鼠都沒出現(xiàn)感染、死亡情況。造模后大鼠飲食正常,左后肢出現(xiàn)輕度跛行、避免負重,無撕咬,沒有大小便失禁情況,易激怒,魏氏核歸丸干預后情況明顯好轉。
2.2 各組大鼠左后肢機械刺激縮爪疼痛閾值結果比較 見圖1。術后5 d,與假手術組比較,模型組大鼠左后肢縮爪閾值均顯著降低(P<0.05)。灌胃7天,與模型組比較,高、中劑量組大鼠左后肢縮爪閾值均顯著升高(P<0.05),低劑量組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),高劑量組閾值上升最快,但高劑量組與中劑量組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與灌胃7天比較,高劑量組大鼠灌胃14天時閾值顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且閾值趨近于假手術組(P>0.05)。
圖1 各組大鼠左后肢機械刺激縮爪疼痛閾值
2.3 各組大鼠髓核組織HE染色結果比較 見圖2。假手術組椎間盤組織形態(tài)結構完整,多層纖維環(huán)排列整齊,髓核形態(tài)正常。模型組纖維環(huán)大面積壞死,且髓核數(shù)量明顯減少、結構基本消失,周圍出現(xiàn)大量透明骨質(zhì)增生,正常椎間盤結構消失。低劑量組纖維環(huán)壞死明顯減少,髓核數(shù)量有所增加,椎間盤、髓核組織形態(tài)有所恢復,透明骨質(zhì)增生有所降低。中劑量組顯示椎間盤形態(tài)基本恢復正常,異常透明骨質(zhì)基本消失,髓核形態(tài)增加,纖維環(huán)形態(tài)數(shù)量恢復正常,排列整齊。高劑量組顯示椎間盤形態(tài)正常,纖維環(huán)數(shù)量恢復正常且排列有序,髓核形態(tài)正常。
圖2 各組大鼠髓核組織HE染色結果 (×100)
2.4 各組大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表達變化結果比較見表1。灌胃7天和14天,與假手術組比較,模型組大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,低、中、高劑量組大鼠MMP2、MMP9蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05),且隨著劑量的升高MMP2、MMP9蛋白表達水平越低,但仍高于假手術組(P<0.05);與灌胃7天比較,低、中、高劑量組在灌胃14天時MMP2、MMP9蛋白的表達水平均有所降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
表1 灌胃后各組大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表達變化結果
2.5 各組大鼠髓核TIMP1蛋白表達變化結果比較 見表2。灌胃7天和14天,與假手術組比較,模型組大鼠髓核TIMP1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,低、中、高劑量組大鼠TIMP1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05),且隨著劑量的升高TIMP1蛋白表達水平越高;與灌胃后7天比較,低、中、高劑量組大鼠TIMP1蛋白在灌胃14天時的表達水平有所降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
表2 各組大鼠髓核TIMP1蛋白表達變化結果
LDH在中醫(yī)學中屬于腰痛、腰腿痛等范疇,基于肝腎脾不足,尤其是腎虛,由外傷或氣滯寒凝等引起[8~9]。中醫(yī)內(nèi)治LDH藥物以補肝益腎、活血化瘀為主[10]。魏氏核歸丸是在傳統(tǒng)核歸丸的基礎上,結合LDH的病因、癥狀,加入強腰膝、祛風濕、固腎氣的狗脊,祛風濕、止痛的獨活,活血、利氣、止痛的醋延胡索等,為駐馬店魏道德骨科醫(yī)院長期臨床實踐總結而得,主治腰椎間盤突出、椎管狹窄、腰肌勞損、頸椎間盤突出,在臨床上應用多年,取得良好療效?,F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)活血祛瘀藥物可減小血液黏稠度、擴張血管,進而改善血液循環(huán),補腎藥物可調(diào)節(jié)機體代謝、提高機體免疫力[11~12]。魏氏核歸丸具有補腎壯骨、滋肝養(yǎng)筋、行氣活血、祛風除濕、扶正祛邪的功效。本研究通過動物實驗探究魏氏核歸丸治療LDH的內(nèi)在分子機制,為中藥的現(xiàn)代化研究提供參考。
本研究采用自體椎間盤移植方法制備LDH大鼠模型,所有大鼠都未感染、死亡。造模后大鼠左后肢跛行、易激怒。HE染色結果說明魏氏核歸丸治療可明顯改善LDH大鼠的生物學行為及其髓核病理特征,且可緩解大鼠痛覺過敏情況。這些結果與魏氏核歸丸及其他核歸丸的臨床治療效果一致[13~15]。
腰椎間盤退變是LDH發(fā)生的重要內(nèi)因,常表現(xiàn)為椎間盤基質(zhì)成分改變,椎間盤細胞外基質(zhì)成分一般處于動態(tài)平衡之中,椎間盤退變象征該平衡遭受破壞,MMP及其抑制劑TIMP在其中發(fā)揮關鍵作用[16]。細胞外基質(zhì)指位于結締組織細胞外圍、內(nèi)皮與上皮細胞下層,為組織、器官以及生物體提供韌性與強度的物質(zhì)。膠原蛋白、蛋白多糖是椎間盤細胞外基質(zhì)的主要成分,胞間框架結構主要有膠原構成,而蛋白多糖可與水結合起著對抗外壓、分散負荷的作用。椎間盤由中央髓核和外周纖維環(huán)構成,髓核膠原無Ⅰ型多為Ⅱ型,而纖維環(huán)從外向里Ⅰ型膠原不斷減少,Ⅱ型膠原、聚合蛋白多糖逐漸增多[17]?;|(zhì)降解酶系有脯肽酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)6大類,其中MMP分布于多類細胞中,可廣泛降解多種基質(zhì),在維持基質(zhì)動態(tài)平衡中發(fā)揮最重要的作用,與癌細胞擴散、腹膜炎、關節(jié)炎、燒傷、椎間盤退變等病癥及正常組織的吸收、更新密切相關[18~19]。研究發(fā)現(xiàn)椎間盤退變時髓核中Ⅱ型膠原被Ⅰ型取代,且有Ⅲ型膠原出現(xiàn),而聚合蛋白多糖含量下降,硫酸軟骨素與硫酸角質(zhì)素比值下降等生物學變化[6]。椎間盤退變的直接原因是椎間盤中含有過量的MMP,MMP/TIMP失衡,椎間盤細胞活性不足,不能維持、修復胞外基質(zhì)成分。腰部重負荷、強扭轉、駕駛振動等機械因素是引起腰椎間盤突出的常見誘因。研究顯示,腰部負荷異常改變可導致MMP/TIMP失衡,造成椎間盤基質(zhì)過度降解[20]。本研究結果顯示,灌胃后7天和14天,模型組、魏氏核歸丸組大鼠髓核MMP2、MMP9、TIMP1蛋白表達水平較假手術組均顯著較高,MMP2、MMP9增加量高,而TIMP1增加量相對較少,說明LDH大鼠髓核MMP2、MMP9、TIMP1含量增多,MMP/TIMP失衡。魏氏核歸丸干預后MMP2、MMP9表達水平均顯著低于模型組,TIMP1表達水平均顯著高于模型組,且隨著魏氏核歸丸劑量的升高,MMP2、MMP9表達水平越來越低,TIMP1表達水平越來越高,說明魏氏核歸丸可緩解MMP/TIMP失衡情況,避免胞外基質(zhì)過度降解。由此說明魏氏核歸丸可能通過抑制大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表達,促進TIMP1表達,來減輕LDH大鼠的病情。
綜上,本研究通過自體椎間盤移植方法成功制備LDH大鼠模型,模型組大鼠腰部髓核中MMP2、MMP9、TIMP1蛋白表達水平顯著增加,魏氏核歸丸治療后LDH大鼠髓核炎癥明顯減輕,且髓核組織中MMP2、MMP9表達水平顯著降低,TIMP1顯著升高,說明魏氏核歸丸可抑制髓核MMP2、MMP9蛋白表達,促進TIMP1表達,緩解LDH大鼠病情。然而LDH發(fā)生發(fā)展的相關因素很多、相關機制復雜,魏氏核歸丸治療LDH的具體作用機理還需繼續(xù)深入探究。