喬璐，李博，李慶

鄭州市第一人民醫(yī)院，河南 鄭州 450008

心肌纖維化是由膠原纖維大量積聚、心肌膠原濃度比例失衡引起的[1～2]。心肌成纖維細(xì)胞(Cardialfibroblasts，CFs)是心肌組織的重要組成部分，病理增殖分化過度時(shí)會(huì)大量分泌膠原蛋白，是形成心肌纖維化的病理基礎(chǔ)[3～4]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是心肌纖維化形成的重要調(diào)控因子，在作用于CFs后，主要通過TGF-β信號(hào)通路中的Smads蛋白，轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)膠原纖維的合成及纖維化的發(fā)展[5～6]。氧化苦參堿(Oxymatrine，OM)為苦參的有效成分，具有抗纖維化、抗炎等作用。既往研究已證實(shí)OM對(duì)心肌細(xì)胞受損有保護(hù)作用，且能夠有效治療心肌纖維化[7]。因此，本研究進(jìn)一步通過OM干預(yù)接受TGF-β1刺激的CFs增殖模型，觀察OM對(duì)該模型的抑制作用及干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取出生1～3 d內(nèi)的新生SD大鼠480只，雌雄不限，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥品與試劑 98%OM(陜西帕尼爾生物科技有限公司)；TGF-β1、熒光定量PCR試劑盒、Vimentin兔抗人波形蛋白及Fibronection兔抗體(美國 Pepro Tech公司)；兔抗 PCNA、α-SMA抗體和DABKit(上海瑞齊生物技術(shù)有限公司)；大鼠Ⅰ型膠原纖維(CoL-Ⅰ)、Ⅲ型膠原纖維(CoL-Ⅲ)ELISA試劑盒(上海晶天生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒(北京中杉金橋公司)，Smad2、Smad3 XPRabbit mAb[賽信通(上海)生物試劑有限公司]。

1.3 CFs的培養(yǎng)及鑒定 用75%的乙醇對(duì)新生SD大鼠皮膚進(jìn)行消毒，固定大鼠四肢，剪取心臟前1/3部分組織，洗凈后轉(zhuǎn)存入青霉素小瓶中，剪為大小不超過1 mm3的碎塊，平鋪在培養(yǎng)瓶底，加入含有10%血清的DEME培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)瓶于95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，保證培養(yǎng)基浸過組織塊后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育，每隔1天更換培養(yǎng)液[8]。待細(xì)胞生長面積沒過瓶底后進(jìn)行傳代，將傳代后3代的CFs作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。通過免疫細(xì)胞化學(xué)法染色證實(shí)細(xì)胞中存在波形蛋白及纖維連接蛋白表達(dá)者，為CFs。培養(yǎng)的CFs分為對(duì)照組、TGF-β1組及觀察組。

1.4 MTT法檢測(cè)CFs增殖情況 細(xì)胞接種、步驟同上。對(duì)照組(無血清DEME)及TGF-β1組采用濃度為20 ng/mL TGF-β1孵育24 h；先對(duì)觀察組采用3.78×10-4mol/L的OM預(yù)處理后，再加入濃度為20 ng/mLTGF-β1孵育24 h，通過免疫檢測(cè)儀上490 nm波長處測(cè)定光吸收值(A490值)，判斷各組CFs增殖情況。

1.5 ELISA法檢測(cè)CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量 將所有處理過的CFs消化離心，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS)制成細(xì)胞懸液，待細(xì)胞濃度達(dá)到1×106個(gè)/mL后，采用復(fù)凍融破壞細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌蛋白，1 500 r/min離心30 min后，用ELISA法檢測(cè)CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量，含量越高則表明細(xì)胞膠原表達(dá)越多，以上操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 RT-PCR檢測(cè)Smad2 mRNA表達(dá)水平 用RNA提取試劑盒提取處理好的CFs的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；嚴(yán)格按照YBRPremix Ex Taq試劑盒操作，加入上、下游引物(Smad2上游序列：ACCACTCTCTC-CCCTGTCAAT，下游序列：CAAACCTAAGCAGAAC-CTCTCC；β-actin上游序列：CACCC GCGAG-TACAACCTTC，下游序列：CCCATACCCACC ATCACACC。)進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù) 2－ΔΔCt進(jìn)行Smad2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分析。

1.7 Westorn blot檢測(cè)α-SMA、PCNA、Smad2及Smad3表達(dá)水平 TGF-β1刺激1 h、24 h后，離心收集細(xì)胞，檢測(cè)α-SMA、PCNA、Smad2及Smad3表達(dá)水平。PBS反復(fù)洗滌，根據(jù)蛋白提取試劑盒提取總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒對(duì)處理好的CFs行蛋白定量，上樣，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜，1%BSA封閉，加一抗稀釋液(1∶1 000)，洗膜后加二抗稀釋液(1∶5 000)，對(duì)所得樣本行免疫蛋白印記分析，通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像，并分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算α-SMA、PCNA、Smad2及Smad3灰度值與β-actin灰度值的比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以n，%表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用(±s)表示，行獨(dú)立t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析3組CFs增殖水平、膠原蛋白及Smads間的差異性及各時(shí)間點(diǎn)測(cè)量值的時(shí)間差異性。

2 結(jié)果

2.1 原代CFs形態(tài)特征 見圖1。顯微鏡觀察組織塊培養(yǎng)的CFs生長情況，3～5天后CFs游出組織塊，呈形態(tài)飽滿的菱形、多角形胞體，均為貼壁生長，胞質(zhì)透明且折光性強(qiáng)。6～10天后細(xì)胞排列緊密，且呈相互融合狀態(tài)。傳代培養(yǎng)保留了原代的特點(diǎn)，采用反復(fù)差速貼壁方法培養(yǎng)，純度更高。免疫細(xì)胞化學(xué)法染色后，顯微鏡下可見波形蛋白細(xì)胞胞質(zhì)被染成棕黃色，纖維連接蛋白染色呈強(qiáng)陽性，均符合CFs染色特征，純度超過99%。

圖1 各時(shí)期CFs形態(tài)（×200）

2.2 各組大鼠CFs增殖水平及CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量結(jié)果比較見表1。與對(duì)照組比較，TGF-β1組CFs的CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量均增加(P＜0.05)；與TGF-β1組比較，觀察組CFs的A490、CoL-Ⅲ均明顯降低(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠CFs Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3表達(dá)結(jié)果比較 見表2、圖2。與對(duì)照組比較，TGF-β1組Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3明顯升高(P＜0.05)；與 TGF-β1組比較，觀察組的 Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3均明顯降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠CFs增殖水平及CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠CFs增殖水平及CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量結(jié)果比較(±s)

與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與TGF-β1組比較，②P＜0.05

組 別對(duì)照組T G F-β 1組觀察組A 4 9 0 0.4 1±0.0 3 0.5 3±0.0 3①0.3 9±0.0 4②C o L-Ⅰ(n g/m L)2.5 7±0.0 5 3.8 6±0.0 2①3.6 2±0.0 5 C o L-Ⅲ(n g/m L)2.9 5±0.0 3 3.8 1±0.0 2①3.1 2±0.0 4②

表2 各組大鼠CFs Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3表達(dá)結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠CFs Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3表達(dá)結(jié)果(±s)

與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與TGF-β1組比較，②P＜0.05

組 別對(duì)照組T G F-β 1組觀察組S m a d 2 m R N A 3.2 6±0.0 2 5.5 7±0.0 3①3.5 2±0.0 4②P C N A(灰度值)0.3 1±0.0 2 0.7 6±0.0 4①0.4 3±0.0 3②α-S M A(灰度值)0.4 2±0.0 4 0.8 4±0.0 3①0.5 3±0.0 2②S m a d 2(灰度值)0.4 5±0.0 2 1.0 2±0.0 3①0.5 8±0.0 4②S m a d 3(灰度值)0.5 1±0.0 3 0.9 7±0.0 4①0.7 6±0.0 5②

圖2 各組大鼠CFs PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3蛋白印跡結(jié)果比較

3 討論

心肌纖維化的形成原因與膠原比例失衡有關(guān)，其病理基礎(chǔ)則是由CFs的增殖分化過度引起的[9～10]。TGF-β1是目前治療器官纖維化的重要靶標(biāo)，是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的重要因子，促進(jìn)細(xì)胞外機(jī)制沉淀積聚，誘導(dǎo)CFs的增殖分化，刺激膠原蛋白的高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解與合成失衡，最終引發(fā)心肌纖維[11]。相關(guān)研究表明，Smad蛋白為TGF-β信號(hào)通路中的主要分子，Smad信號(hào)能夠介導(dǎo)膠原蛋白的合成，且TGF-β1發(fā)揮其生物學(xué)作用也是通過Smads信號(hào)通路完成的[12～13]。

本研究結(jié)果顯示，CFs經(jīng)過TGF-β1的誘導(dǎo)處理后，TGF-β1組的CFs的A490值明顯較對(duì)照組高，但觀察組OM預(yù)處理后的A490值則明顯低于TGF-β1組。提示TGF-β1能夠誘導(dǎo)CFs增殖，但OM能夠有效抑制CFs的增殖。研究表明，OM有較強(qiáng)的抗皮膚、肝纖維化的作用，能夠抑制肝星狀細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)[14]。原因可能是OM為中藥苦參的有效成分，是四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)生物堿，具有抗心律失常、抑制膠原活動(dòng)度及抗纖維化等作用。

PCNA為DNA合成和復(fù)制的輔助因子，是反應(yīng)細(xì)胞增殖情況的標(biāo)志分子之一，PCNA的增加能表明細(xì)胞增殖活躍，可參與肺纖維化的進(jìn)展[15]。α-SMA是肌細(xì)胞的標(biāo)志物，可以作為成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物，α-SMA的高表達(dá)狀態(tài)提示膠原蛋白的合成增加[16]。肌細(xì)胞外間質(zhì)主要成分是CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ，當(dāng)心肌纖維化發(fā)展時(shí)，膠原蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致心臟功能受損。研究證實(shí)，TGF-β1能夠明顯誘導(dǎo)CFs增殖，并促進(jìn)膠原蛋白的合成[17]。本研究結(jié)果表明，TGF-β1組CFs的PCNA、α-SMA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ均明顯高于對(duì)照組。證實(shí)TGF-β1能夠誘導(dǎo)CFs大量增殖，且在TGF-β1刺激下，大量成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，而經(jīng)過轉(zhuǎn)變的成纖維細(xì)胞則會(huì)合成和分泌大量膠原，引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)心肌纖維化的進(jìn)展。而觀察組的PCNA、α-SMA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ均明顯低于TGF-β1組，提示OM能夠改善膠原及細(xì)胞外基質(zhì)大量堆積的情況，阻止纖維化進(jìn)展。

趙娜等[18]研究發(fā)現(xiàn)苦參素能夠抑制TGF-β/Smads信號(hào)通路，有效改善糖尿病心肌病大鼠的心肌纖維化發(fā)展。國外研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化與TGF-β1誘導(dǎo)的Smads的磷酸化以及磷酸化的Smads核移位有關(guān)[19]。本研究結(jié)果也顯示，TGF-β1組CFs Smad2基因、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而觀察組上述指標(biāo)的表達(dá)則明顯低于TGF-β1組。提示心肌纖維化的發(fā)展與Smad2、Smad3密切相關(guān)。且可以從中發(fā)現(xiàn)OM能夠有效抑制TGF-β1的表達(dá)，從而降低Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平，起到阻斷TGF-β/Smads信號(hào)通路，減少細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，降低膠原蛋白的大量分泌，抗纖維化的作用。

綜上，OM能夠明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFs增殖與分化，主要作用機(jī)制可能與降低心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的Smad2、Smad3蛋白表達(dá)，進(jìn)而阻斷TGF-β/Smads信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)。具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步的臨床研究。