戶紅通，徐 達(dá)，徐慶陽，2，3*，陳 寧，2，3

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457）

現(xiàn)有谷氨酸發(fā)酵的主要問題是發(fā)酵液色澤深、黏度大、雜質(zhì)多，造成起泡嚴(yán)重、溶解氧不足、傳質(zhì)困難、發(fā)酵過程不穩(wěn)定[1]。其中的主要原因是發(fā)酵培養(yǎng)基中添加大量的玉米漿和豆粕水解液這類色素深、雜質(zhì)多的發(fā)酵氮源，同時對于“生物素亞適量型”谷氨酸發(fā)酵，玉米漿中生物素的波動也造成了發(fā)酵的不穩(wěn)定。

谷氨酸發(fā)酵的氮源主要來源于玉米漿和豆粕水解液，玉米漿和豆粕水解液含有豐富的有機氮源、多種維生素及促進(jìn)菌體生長的微量元素等多種生長因子，能夠促進(jìn)菌體的快速生長并維持較高的菌體酶活力[2]。但在谷氨酸的發(fā)酵過程中并不能大量添加玉米漿，主要原因是玉米漿中含有較多的生物素，對于“生物素亞適量型”谷氨酸生產(chǎn)菌而言，過多的生物素會限制菌體細(xì)胞膜的通透性，使得谷氨酸非生產(chǎn)菌向谷氨酸生產(chǎn)菌的轉(zhuǎn)變不完全，發(fā)酵產(chǎn)酸較低[3-4]。另外，玉米漿和豆粕水解液中含有大量的色素，尤其是玉米漿中還有大量的不可被菌體利用的蛋白質(zhì)、少量的淀粉、纖維素以及不可被菌體利用的有毒有害物質(zhì)[5-7]。這些物質(zhì)的大量存在，不但引起發(fā)酵液黏度大、易起泡、溶氧效率低、攪拌功率低以及生物素含量不穩(wěn)定等問題，同時引起發(fā)酵過程難于控制、發(fā)酵不穩(wěn)定，而且還進(jìn)一步給后續(xù)的谷氨酸發(fā)酵提取帶來困難，增加了生產(chǎn)成本[8]。因此，需要對谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整，尋找雜質(zhì)、色素等較少且營養(yǎng)豐富的有機氮源，對玉米漿和豆粕水解液進(jìn)行替代是主要的解決方法[9]。

本研究在對玉米漿和豆粕水解液主要成分充分了解的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了發(fā)酵氮源的近似等效替代。首先使用生物氮素（含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)及小分子肽等）作為氮源，維生素B1（vitamin B1，VB1）作為生長因子，生物素使用定量配制的溶液添加，由于所使用的谷氨酸生產(chǎn)菌是甲硫氨酸缺陷型菌株[10]，故另外添加一定量的甲硫氨酸，其他培養(yǎng)基成分維持不變，采用單因素及正交試驗法，確定了清潔培養(yǎng)基的最佳配比，最終得到谷氨酸清潔發(fā)酵培養(yǎng)基。清潔發(fā)酵培養(yǎng)基與對照發(fā)酵培養(yǎng)基相比，其最大的優(yōu)點在于大大減少了玉米漿和豆粕水解液中的大量雜質(zhì)、色素以及毒害物質(zhì)，所得的發(fā)酵液澄清度大大增加，黏度降低，泡沫少，使得發(fā)酵液溶氧效率得到提高，攪拌功率降低，發(fā)酵過程更加容易控制，生物素的定量添加使得發(fā)酵產(chǎn)酸更加穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)酸量也得到了提高。本研究的目的在于獲得相對清潔的發(fā)酵培養(yǎng)基，減少雜質(zhì)含量、提高發(fā)酵液質(zhì)量和提高發(fā)酵穩(wěn)定性，最終也相應(yīng)地提高了發(fā)酵產(chǎn)酸和糖酸轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

生物素亞適量型黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）GDK-168：由天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏。

1.1.2 試劑

生物氮素（總氮≥11.0%，氨基酸態(tài)氮≥3.0%，水分≤7.0%，灰分≤10.0%）：麥迪爾生物科技江蘇有限公司；葡萄糖、Na2HPO4、MgSO4、KCl、VB1、VH（生物素）、MnSO4、FeSO4、甲硫氨酸、豆粕水解液、玉米漿：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

對照發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80g/L，Na2HPO4·12H2O2.83g/L，MgSO4·7H2O 1.83g/L，KCl 1.33g/L，MnSO4·H2O 2.33 mg/L，VB10.233 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.33 mg/L，糖蜜1.1 g/L，豆粕水解液10 mL/L，玉米漿4 mL/L。121℃高壓滅菌15 min。

清潔發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80g/L，Na2HPO4·12H2O2.83g/L，MgSO4·7 H2O 1.85 g/L，KCl 1.5 g/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.5 mg/L，生物氮素、VB1、VH（生物素）及甲硫氨酸。121℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機械廠；MCGS 5 L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐、MCGS 30 L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；A300氨基酸分析儀：德國安米諾西斯公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗優(yōu)化培養(yǎng)基組分

（1）生物氮素對谷氨酸發(fā)酵的影響

維持部分對照谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分（葡萄糖80 g/L，Na2HPO4·12H2O2.83g/L，KCl1.33g/L，MnSO4·H2O2.33mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.33mg/L，MgSO4·7H2O 1.83g/L）不變（下同），在生物素5 μg/L、VB16 mg/L、甲硫氨酸1.0 g/L的條件下，考察不同生物氮素添加量（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L）對谷氨酸發(fā)酵的影響。

（2）生物素對谷氨酸發(fā)酵的影響

在生物氮素最佳添加量、VB16 mg/L、甲硫氨酸1.0g/L的條件下，考察不同生物素添加量（3 μg/L、5 μg/L、7 μg/L、9 μg/L、11 μg/L）對谷氨酸發(fā)酵的影響。

（3）VB1對谷氨酸發(fā)酵的影響

在最佳生物氮素添加量、最佳生物素添加量、甲硫氨酸1.0 g/L的條件下，考察不同VB1添加量（2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L）對谷氨酸發(fā)酵的影響。

（4）甲硫氨酸對谷氨酸發(fā)酵的影響

在最佳生物氮素添加量、最佳生物素添加量、最佳VB1添加量的條件下，考察不同甲硫氨酸添加量（0.4g/L、0.6g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L）對谷氨酸發(fā)酵的影響。

1.3.2 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基組分

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以生物氮素（A）、生物素（B）、VB1（C）和甲硫氨酸（D）添加量為研究因素，以O(shè)D600nm值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗表對谷氨酸清潔培養(yǎng)基的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行研究。正交試驗因素與水平見表1。

表1 谷氨酸清潔發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium composition optimization of glutamic acid clean fermentation

1.3.3 檢測分析方法

OD600nm值采用發(fā)酵液稀釋100倍后測定的數(shù)據(jù)再乘以100表示。谷氨酸產(chǎn)量及發(fā)酵參數(shù)的測定參見參考文獻(xiàn)[11-12]；有機酸的測定使用高效液相色譜分析儀進(jìn)行。取1mL發(fā)酵液于1.5mL離心管中，13000r/min離心2min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾，使用液相色譜儀進(jìn)行檢測，色譜條件：色譜柱為Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm），0.05 mol/L硫酸緩沖液洗脫，柱溫30℃，流速0.5 mL/min，檢測波長210 nm；采用氨基酸分析儀測定發(fā)酵液中氨基酸的含量，發(fā)酵液的處理與有機酸相同，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾，使用氨基酸分析儀進(jìn)行定量檢測，色譜條件：色譜柱為LCAK06/Na色譜柱（4.6 mm×150 mm），緩沖液A（乙腈∶水=1∶1）和緩沖液B（4.1 g/L乙酸鈉）洗脫，柱溫57℃，流速0.45 mL/min，檢測波長570 nm和440 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 生物氮素對谷氨酸清潔發(fā)酵的影響

在VH（生物素）為5 μg/L，VB1為6 mg/L，甲硫氨酸為1.0 g/L的條件下，不同生物氮素添加量對谷氨酸發(fā)酵的影響見圖1。由圖1可以看出，隨著生物氮素的添加量在0.5～1.5 g/L范圍內(nèi)不斷增加，OD600nm值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率都呈上升趨勢；當(dāng)生物氮素添加量為1.5 g/L時，OD600nm值為82、谷氨酸產(chǎn)量為165 g/L、糖酸轉(zhuǎn)化率為68%；但當(dāng)生物氮素添加量＞1.5g/L之后，三者的值都呈現(xiàn)波動趨勢，而不是繼續(xù)增加。分析可知，在現(xiàn)有的發(fā)酵條件下，生物氮素的添加量為1.5 g/L時能夠提供足夠的發(fā)酵氮源，不再是發(fā)酵的限制性底物，同時，生物量、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率也達(dá)到了較高的值。過多的氮源不但造成浪費，而且會改變谷氨酸的代謝途徑[13]，引起異常發(fā)酵。因此，選取1.5 g/L作為生物氮素的最佳添加量。

圖1 生物氮素添加量對谷氨酸清潔發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of biological nitrogen addition on clean fermentation of glutamic acid

2.1.2 生物素對谷氨酸清潔發(fā)酵的影響

在生物氮素最佳添加量為1.5 g/L，VB1為6 mg/L，甲硫氨酸為1.0g/L的條件下，不同添加量生物素對谷氨酸發(fā)酵的影響見圖2。由圖2可以看出，隨著生物素添加量在3～7μg/L范圍內(nèi)的增加，OD600nm值不斷增加，谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率增加的更快；當(dāng)生物素添加量為7 μg/L時，OD600nm值為82、谷氨酸產(chǎn)量為166 g/L、糖酸轉(zhuǎn)化率為67.8%；當(dāng)生物素量＞7 μg/L之后，OD600nm值增長緩慢，而谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率則快速下降。分析可知，由于生物素作為多種尤其是催化脂肪酸合成的乙酰輔酶A羧化酶、丙酮酸羧化酶等的輔酶，能夠參與細(xì)胞膜的合成、CO2的固定和羧化過程[14]。當(dāng)其添加量增加時，CO2固定反應(yīng)加強，進(jìn)一步促進(jìn)三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA），能夠加快菌體的生長，同時增加谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。但是當(dāng)生物素的添加量超過“亞適量”范圍后，細(xì)胞膜的合成量將大大增加，大量的菌體不能或不完全能實現(xiàn)從非谷氨酸積累型向谷氨酸積累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[15]。因此，谷氨酸的分泌量和糖酸轉(zhuǎn)化率開始下降，綜合衡量，選取7 μg/L作為最佳生物素的添加量。

圖2 生物素添加量對谷氨酸清潔發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of biotin addition on clean fermentation of glutamic acid

2.1.3 VB1對谷氨酸清潔發(fā)酵的影響

在生物氮素最佳添加量為1.5 g/L，生物素最佳添加量為7 μg/L，甲硫氨酸為1.0 g/L的條件下，添加不同量VB1對谷氨酸發(fā)酵的影響見圖3。由圖3可以看出，隨著VB1添加量在2～8 mg/L的范圍內(nèi)增加，OD600nm值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢，尤其是后兩者快速增加；當(dāng)VB1添加量為8 mg/L時，OD600nm值為81、谷氨酸162 g/L和糖酸轉(zhuǎn)化率為67.5%；而VB1的添加量＞8 mg/L后，OD600nm值不再繼續(xù)增加，而谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率持續(xù)上升，但增加速度變慢。VB1作為谷氨酸生產(chǎn)菌的多種生長因子，它是多種關(guān)鍵酶的輔酶和輔基，添加大量的VB1能夠極大提高多種酶的酶活力，加快菌體生長，提高菌活力，進(jìn)而促進(jìn)了谷氨酸的分泌和糖酸轉(zhuǎn)化率的提高[16]。因此，選取8 mg/L作為VB1的最佳添加量。

圖3 VB1添加量對谷氨酸清潔發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of VB1 addition on clean fermentation of glutamic acid

2.1.4 甲硫氨酸對谷氨酸清潔發(fā)酵的影響

在生物氮素最佳添加量為1.5g/L，生物素最佳添加量為7μg/L，VB1最佳添加量為8mg/L的條件下，添加不同量甲硫氨酸對谷氨酸發(fā)酵的影響見圖4。由圖4可以看出，OD600nm值和谷氨酸產(chǎn)量隨著甲硫氨酸在0.4～1.2 g/L范圍的增加而不斷增加；而糖酸轉(zhuǎn)化率在甲硫氨酸添加量在0.4～0.8 g/L范圍呈上升趨勢，當(dāng)甲硫氨酸的添加量分別為0.8g/L、1.0g/L和1.2 g/L時，其所對應(yīng)的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為67.6%、67.5%和67.6%，此時糖酸轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)波動，甲硫氨酸已不是影響轉(zhuǎn)化率的主要因素。甲基化在菌體的生物合成與代謝中發(fā)揮著重要的作用，尤其對蛋白質(zhì)和核酸的修飾加工也極為重要。而甲硫氨酸作為體內(nèi)最重要的甲基供體，經(jīng)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的進(jìn)一步活化生成S-腺苷甲硫氨酸（最直接有效的甲基供體），能夠提供活化的甲基。四氫乙酸雖然能夠攜帶甲基，但由于轉(zhuǎn)運勢能低、不能直接將甲基轉(zhuǎn)移至甲基受體，而是轉(zhuǎn)移至同型半胱氨酸生成甲硫氨酸[17]。因此，在培養(yǎng)基中添加一定量的甲硫氨酸能夠促進(jìn)了菌體的快速生長，進(jìn)而提高谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。因此，選擇0.8 g/L作為甲硫氨酸的最佳添加量。

圖4 甲硫氨酸添加量對谷氨酸清潔發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of methionine addition on clean fermentation of glutamic acid

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

以菌體OD600nm值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率作為考察指標(biāo)，根據(jù)表1所設(shè)計的正交試驗進(jìn)行正交優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由正交試驗結(jié)果及極差（R）分析可知，影響OD600nm值的4個因素次序為A＞D＞C＞B，即生物氮素＞甲硫氨酸＞VB1＞生物素，最佳添加量組合為A3B1C3D1，即生物氮素2.0 g/L、生物素5 μg/L、VB110 mg/L、甲硫氨酸0.6 g/L；影響谷氨酸產(chǎn)量的4個因素次序為B＞A＞C＞D，即生物素＞生物氮素＞VB1＞甲硫氨酸，最佳添加量組合為A3B2C2D2，即生物氮素2.0 g/L、生物素7 μg/L、VB18 mg/L、甲硫氨酸0.8 g/L；影響糖酸轉(zhuǎn)化率的4個因素次序為B＞C＞A＞D，即生物素＞VB1＞生物氮素＞甲硫氨酸，最佳添加量組合為A2B1C3D1，即生物氮素1.5 g/L、生物素5 μg/L、VB110 mg/L、甲硫氨酸0.6g/L。

表2 谷氨酸清潔發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for clean fermentation medium composition optimization of glutamic acid

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，生物氮素對OD600nm值影響顯著（P＜0.05），生物素對谷氨酸影響顯著（P＜0.05），生物氮素、生物素和VB1對糖酸轉(zhuǎn)化率影響顯著（P＜0.05）。

綜合考慮以上試驗結(jié)果，在滿足一定量OD600nm值的情況下，又同時有較高的谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，因此，最佳添加量組合選取A3B2C3D1，即生物氮素2.0 g/L、生物素7 μg/L、VB110 mg/L、甲硫氨酸0.6 g/L。

2.3 清潔發(fā)酵培養(yǎng)基驗證試驗

2.3.1 清潔發(fā)酵培養(yǎng)基對OD600nm值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

對照發(fā)酵與清潔發(fā)酵的考察指標(biāo)對比情況結(jié)果見圖5。由圖5可知，相對于對照發(fā)酵，清潔發(fā)酵的OD600nm值和谷氨酸產(chǎn)量都有較大的提高，糖酸轉(zhuǎn)化率雖然不明顯，但是也有一定程度的提升?？偟膩碚f，OD600nm值由對照發(fā)酵的72.5提升至84.2，提高16.14%；谷氨酸由152 g/L提高至171 g/L，提高12.50%；糖酸轉(zhuǎn)化率由65.4%提升至68.5%，提高4.74%。

圖5 清潔發(fā)酵與對照發(fā)酵對考察指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of clean and control fermentation on evaluation indicators

2.3.2 清潔發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵參數(shù)的影響

對照發(fā)酵培養(yǎng)基和清潔發(fā)酵培養(yǎng)基所獲得的發(fā)酵上清液的透光率結(jié)果見圖6。

圖6 清潔發(fā)酵對發(fā)酵液透光率的影響Fig.6 Effect of clean fermentation on the light transmittance of fermentation liquor

由圖6可知，對照發(fā)酵的發(fā)酵液透光率非常低，因為其含有大量的色素及不可被菌體分解利用的雜質(zhì)，菌體所產(chǎn)生的影響透光性的物質(zhì)相對培養(yǎng)基自身的雜質(zhì)可以忽略不計，因而其透光率呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢。而雖然清潔發(fā)酵的發(fā)酵液透光率隨著菌體產(chǎn)生雜質(zhì)的增多而不斷下降，但是其總體透光率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照發(fā)酵，尤其對后續(xù)的谷氨酸分離提取而言，可以大幅度降低生產(chǎn)成本[18]。發(fā)酵結(jié)束時的對照發(fā)酵上清液透光率為0.9%，清潔發(fā)酵的上清液透光率為31%。

進(jìn)一步分析可知，玉米漿、豆粕水解液和糖蜜的替代，大大減少了發(fā)酵液中的不可被菌體分解利用的雜蛋白以及有毒害作用的物質(zhì)，降低了發(fā)酵液的黏度、減少了泡沫的生成量、提高了氧的溶解效率[19]。清潔發(fā)酵對消泡劑用量及副產(chǎn)物影響的結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，消泡劑的用量也由對照發(fā)酵的1.0 g/L降低至0.7 g/L。由于溶氧效率的提高，對于TCA循環(huán)而言，其產(chǎn)生的還原力煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）+H+和黃素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，F(xiàn)ADH2）很大程度上可以使用O2作為氫受體，進(jìn)而減少丙酮酸作為氫受體，因此副產(chǎn)物乳酸的生成量減少[20]。TCA循環(huán)的加強，減少了丙酮酸的積累，進(jìn)而使得副產(chǎn)物丙氨酸的生成量降低[21]。從圖7可以看出，乳酸的生成量由對照發(fā)酵的3.7g/L降低至2.4g/L，丙氨酸的生成量由對照發(fā)酵的2.60g/L降低至1.86 g/L。

圖7 清潔發(fā)酵對消泡劑用量及副產(chǎn)物的影響Fig.7 Effects of clean fermentation on defoamer dosage and by-products

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗對谷氨酸對照發(fā)酵培養(yǎng)基中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳添加量，即生物氮素2.0 g/L、生物素7 μg/L、VB110 mg/L、甲硫氨酸0.6 g/L，獲取谷氨酸清潔發(fā)酵培養(yǎng)基。應(yīng)用生物氮素作為發(fā)酵氮源的清潔發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，其獲得的菌體OD600nm值為84.2，谷氨酸產(chǎn)量為171 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為68.5%，發(fā)酵上清液透光值高達(dá)31%。對比可知，本研究所獲得的谷氨酸清潔發(fā)酵培養(yǎng)基取得了比對照發(fā)酵培養(yǎng)基和復(fù)合氨基酸粉或棉籽餅粉作為發(fā)酵氮源更好的發(fā)酵結(jié)果，并解決了谷氨酸生產(chǎn)中色素、雜質(zhì)多的問題，實現(xiàn)了谷氨酸高效清潔生產(chǎn)。另外，該清潔發(fā)酵培養(yǎng)基中是否可以通過添加其他種類的維生素、氨基酸等提高菌體活力的物質(zhì)，進(jìn)一步提高谷氨酸發(fā)酵效益，有待于更多的研究探索。