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        防腐生肌膏對基質(zhì)金屬蛋白酶變化的影響

        2018-11-02 08:41:10李叔洪姜曉文于文會
        動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2018年10期
        關(guān)鍵詞:生肌膏膠原防腐

        李叔洪,姜曉文,辛 秀,于文會

        (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

        創(chuàng)傷愈合是一個復(fù)雜的過程[1]。創(chuàng)面愈合過程中,遷移增生的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,分泌的細(xì)胞外基質(zhì)起到重要作用,它可以為細(xì)胞提供移動的網(wǎng)絡(luò)和向?qū)?,把?xì)胞黏附在一起,對組織的愈合起到骨架作用,并且影響各種生長因子生物活性及其調(diào)節(jié)作用[2]。Ⅰ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一,主要起到支架的作用,與皮膚的張力大小有關(guān),Ⅲ型膠原則決定膠原纖維的直徑的大小和彈性的好壞[3]。Ⅲ型膠原含量越高、越細(xì),彈性越好,形成的瘢痕越輕,所以提高Ⅲ型膠原的比例,對于創(chuàng)傷愈合質(zhì)量是很重要的[4]。

        基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一個需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作輔助因子的大家族,目前MMPs家族已分離鑒別出20多個的成員,分別為MMP1-20等[5],其主要生理作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)。在創(chuàng)傷愈合的早期,MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原肽段,并產(chǎn)生趨化因子,加速炎性細(xì)胞的吞噬作用,對于炎性反應(yīng)區(qū)的清潔有著重要的作用[6]。其中,MMP-1和膠原有密切的相關(guān)性[7],可以分解創(chuàng)面膠原,減少創(chuàng)面膠原的大量表達(dá)聚集,使膠原的合成和分解處于平衡狀態(tài),特別是對創(chuàng)面Ⅰ、Ⅲ型膠原的降解起關(guān)鍵作用,在創(chuàng)面愈合中組織重塑階段起到極其重要的作用。MMP-2在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用,在創(chuàng)傷愈合早期瘢痕組織、肉芽組織形成中發(fā)揮作用。MMP-9也稱為明膠酶B,它可參與創(chuàng)傷修復(fù)過程的幾個早期步驟,參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解,對Ⅰ型前膠原的合成物有明顯的影響,在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合中主要起到延長組織重塑的作用[8]?;|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)是MMPs的內(nèi)源性特異性抑制因子,有4種類型,分別為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。其中,TIMP-1可以特異性地與MMP-1和MMP-9結(jié)合從而抑制其表達(dá)[9],TIMP-2是MMP-2的特異性抑制劑,可以有效的抑制MMP-2的活性[10],這種相互作用在創(chuàng)傷愈合的過程中促進(jìn)了創(chuàng)面組織中膠原的降解,防止創(chuàng)面膠原過度沉積導(dǎo)致瘢痕形成[11-12]。

        防腐生肌膏是由血竭、乳香、沒藥、紫草、三七等中藥組成制備的油膏。本方是在傳統(tǒng)防腐生肌散原方的基礎(chǔ)上,經(jīng)過篩選、優(yōu)化制備而成的外用治療創(chuàng)傷愈合的膏劑。本試驗(yàn)就是應(yīng)用制備好的防腐生肌膏作用于大鼠的皮膚破損模型,觀察防腐生肌膏對創(chuàng)面肉芽組織中基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑表達(dá)量的測定,來闡明防腐生肌膏在創(chuàng)傷愈合過程中的作用機(jī)理。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        SD大鼠50只,雌雄各半,體重200 g±20 g,購自哈爾濱漢方實(shí)驗(yàn)動物繁殖中心;防腐生肌膏主要由血竭、乳香、沒藥、三七、紫草、黃柏、冰片(哈爾濱市藥材公司產(chǎn)品)組成,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備;大鼠MMP-1 ELISA試劑盒、大鼠MMP-2 ELISA試劑盒、大鼠MMP-9 ELISA試劑盒、大鼠TIMP-1 ELISA試劑盒、大鼠TIMP-1 ELISA試劑盒,上海北諾生物科技有限公司產(chǎn)品。

        1.2 方法

        1.2.1 動物皮膚缺損模型的制備及給藥方法 健康SD大鼠50只,常規(guī)飼養(yǎng),7 d后開始造模。造模前用犬眠寶麻醉大鼠,麻醉后的大鼠俯臥固定,背部正中左右兩側(cè)距脊柱1 cm處各選擇1塊5 cm×5 cm的完整皮膚,100 g/L硫化鈉脫毛處理,生理鹽水清洗擦干局部涂抹碘酊進(jìn)行消毒,選用自體對照法,在大鼠背部設(shè)定皮膚右側(cè)為防腐生肌膏組,左側(cè)為空白對照組,在脫毛處剪成2 cm×2 cm的傷口,深達(dá)肌筋膜,大鼠分籠進(jìn)行飼養(yǎng),并給以充足的水和食物。防腐生肌膏組的創(chuàng)面每天進(jìn)行常規(guī)消毒,涂抹防腐生肌膏,厚度約2 mm,每天1次,至完全愈合;空白對照組的創(chuàng)面每日常規(guī)消毒,涂抹20 g/L碘酊[13]。

        1.2.2 樣品采集 造模后第3、7、10、14天,隨機(jī)選取每組各10只大鼠取樣,使用乙醚麻醉,剪刀剪取大鼠創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣正常皮膚間的新生的肉芽組織部分,約0.5 cm2,置-80℃冰箱中保存。

        1.2.3 檢測指標(biāo)及方法 將采集的樣本與PBS 1∶9進(jìn)行研磨,3 000 r/min離心20 min,取上清,分裝后置于-20℃?zhèn)溆?。采用ELISA檢測上清中的 MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的含量,重復(fù)3次[14]。

        2 結(jié)果

        2.1 防腐生肌膏對創(chuàng)面組織表達(dá)MMP-1調(diào)節(jié)

        創(chuàng)傷后第1天,防腐生肌膏組與對照組創(chuàng)面都開始表達(dá)MMP-1,兩組比較差異不顯著(P>0.05)。創(chuàng)傷后第3天,防腐生肌膏組創(chuàng)面MMP-1的表達(dá)量最高,與對照組差異顯著(P<0.05)。創(chuàng)傷后第7天、第10天、第14天,隨著創(chuàng)傷時間延長表達(dá)量逐漸減弱,且防腐生肌膏組創(chuàng)面MMP-1表達(dá)量極顯著高于對照組(P<0.01)(圖1)。

        與對照組相比較,**代表差異極顯著(P<0.01),*代表差異顯著(P<0.05)

        ** represents extremely significant difference (P<0.01),* shows significant difference (P<0.05),compared with the control group

        圖1防腐生肌膏對創(chuàng)面MMP-1表達(dá)的影響

        Fig.1 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression of
        MMP-1 in the wound

        2.2 防腐生肌膏對創(chuàng)面組織表達(dá)MMP-2調(diào)節(jié)

        創(chuàng)傷后第1天,防腐生肌膏組與對照組開始表達(dá)MMP-2,兩組差異不顯著;創(chuàng)傷后第3天、第7天防腐生肌膏組創(chuàng)面MMP-2表達(dá)量逐漸增加,第10天達(dá)到高峰,之后開始減弱;創(chuàng)傷后第10天、第14天,表達(dá)量與對照組比較差異極顯著(P<0.01)(圖2)。

        與對照組相比較,**代表差異極顯著(P<0.01)

        ** represents extremely significant difference (P<0.01)

        圖2防腐生肌膏對創(chuàng)面MMP-2表達(dá)的影響

        Fig.2 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
        of MMP-2 in the wound

        2.3 防腐生肌膏對創(chuàng)面組織表達(dá) MMP-9 調(diào)節(jié)

        創(chuàng)傷第1天,防腐生肌膏組與對照組都開始表達(dá)MMP-9,隨著創(chuàng)傷時間延長,在創(chuàng)傷后第3天達(dá)到表達(dá)高峰,之后逐漸減弱。防腐生肌膏組與對照組比較,防腐生肌膏能極顯著促進(jìn)創(chuàng)面表達(dá)MMP-9(P<0.01)(圖3)。

        2.4 防腐生肌膏對創(chuàng)面組織表達(dá) TIMP-1 調(diào)節(jié)

        創(chuàng)傷開始后,創(chuàng)面就開始表達(dá)TIMP-1,隨著創(chuàng)傷時間延長,防腐生肌膏組與對照組比較,TIMP-1的表達(dá)量逐漸減少,并且極顯著低于對照組(P<0.01)(圖4)。

        與對照組相比較,**代表差異極顯著(P<0.01)

        ** represents extremely significant difference (P<0.01)

        圖3防腐生肌膏對創(chuàng)面MMP-9表達(dá)的影響

        Fig.3 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
        of MMP-9 in the wound

        與對照組相比較,**代表差異極顯著(P<0.01)

        ** represents extremely significant difference (P<0.01)

        圖4防腐生肌膏對創(chuàng)面TIMP-1表達(dá)的影響

        Fig.4 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
        of TIMP-1 in the wound

        2.5 防腐生肌膏對創(chuàng)面表達(dá) TIMP-2 調(diào)節(jié)

        創(chuàng)傷開始后,創(chuàng)面就開始表達(dá)TIMP-2,隨著創(chuàng)傷時間延長,防腐生肌膏組與對照組比較,TIMP-2表達(dá)量逐漸減少,并且極顯著低于對照組(P<0.01)(圖5)。

        與對照組相比較,**代表差異極顯著(P<0.01)

        ** represents extremely significant difference (P<0.01)

        圖5防腐生肌膏對創(chuàng)面TIMP-2表達(dá)的影響(ng/mL)

        Fig.5 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
        of TIMP-2 in the wound(ng/mL)

        3 討論

        創(chuàng)傷發(fā)生后,肉芽組織的快速生長能夠促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。肉芽組織主要成分為膠原,主要包括Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原。基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制調(diào)控膠原劑的合成與分解。因此,在創(chuàng)傷修復(fù)過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制在組織中的含量變化,體現(xiàn)了膠原在創(chuàng)口中的積累,代表創(chuàng)口填充的快慢。在創(chuàng)傷修復(fù)中,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-9促進(jìn)膠原的分解,而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1、TIMP-2抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。因此,檢測MMP-1、MMP-2、MMP-9與TIMP-1、TIMP-2含量變化,可以推知膠原在傷口的積累情況。

        試驗(yàn)結(jié)果顯示,創(chuàng)傷第1天,防腐生肌膏組與對照組創(chuàng)面都開始表達(dá)MMP-1、MMP-2、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2,這主要是因?yàn)閯?chuàng)傷早期成纖維細(xì)胞及各種炎性細(xì)胞開始分泌一定量的MMP和TIMP,目的為抑制早期的炎癥反應(yīng)。隨著創(chuàng)傷時間的延長,創(chuàng)傷后第3天,防腐生肌膏組創(chuàng)面MMP-1的表達(dá)量達(dá)到最高,之后表達(dá)量逐漸減少;MMP-2的表達(dá)量隨創(chuàng)傷時間逐漸增加,第10天達(dá)到高峰,之后開始減弱;MMP-9的表達(dá)量創(chuàng)傷后第3天達(dá)到表達(dá)高峰,之后逐漸減弱。從三者的表達(dá)量看,防腐生肌膏組均高于對照組,且差異顯著。研究發(fā)現(xiàn),血竭中的血竭素高氯酸鹽對瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用,且呈劑量依賴性降低Ⅰ、Ⅲ型前膠原的表達(dá)而抑制成纖維細(xì)胞合成膠原促進(jìn)成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。血竭為防腐生肌膏中的主要藥物,試驗(yàn)中防腐生肌膏通過提高M(jìn)MP-1、MMP-2及MMP-9的表達(dá)促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原降解來調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合防止瘢痕組織形成的結(jié)果相一致。Krieglstein C F等[16]研究發(fā)現(xiàn),對試驗(yàn)性腸炎模型的SD大鼠,乳香提取物和11-羰基-β-乙酰乳香酸單體均可以明顯減輕組織損傷程度,具有抗炎作用。組方中乳香、沒藥的配伍從中醫(yī)理論的角度理解,其所涵蓋的藥物相互作用表現(xiàn)為同氣相求,現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn),兩藥配伍的藥效作用通常呈現(xiàn)為藥理作用的協(xié)同增效[17]。另外,方中紫草的活性成分也具有抗炎作用[18]。而方中三七中的活性成分對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖有抑制作用[19-20],縮小瘢痕組織,提高傷口愈合質(zhì)量。防腐生肌膏方中諸藥的共同作用下,調(diào)節(jié)膠原代謝,促進(jìn)組織愈合,減少瘢痕產(chǎn)生。

        防腐生肌膏能通過促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的一個重要機(jī)制是通過調(diào)控MMP-1、MMP-2、MMP-9與TIMP-1、TIMP-2的活性,調(diào)節(jié)膠原代謝,促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。

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