魏春華，劉建奎，戴愛玲，曾建平，林煒明，楊小燕

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364000)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起豬的一種接觸性和高度致死性的傳染病。感染豬會出現(xiàn)高熱、運(yùn)動失調(diào)、后肢無力、皮膚有出血點(diǎn)或出血斑等一系列臨床癥狀[1-2]。豬瘟是危害我國以及世界養(yǎng)豬行業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病[3]。

豬瘟病毒的病毒粒子呈圓形，是含有囊膜的單股正鏈RNA病毒。豬瘟病毒全基因組大小約為12.3 kb，含有一個開放式閱讀框架(open reading frame，ORF)，CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白都是由ORF所編碼，翻譯一條含有3 898個氨基酸的多聚前體蛋白。該蛋白進(jìn)而被分解為E0、E1、E2、Npro、C、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等12種蛋白質(zhì)，其中C、E0、E1、E2為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，另外8種蛋白為非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。

目前，對防控豬瘟最有效且最普遍的措施是疫苗接種，我國豬瘟兔化弱毒苗是國際公認(rèn)最安全有效的弱毒疫苗，有效的控制豬瘟的流行[1,5]。但是我國近幾年豬瘟流行特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，以妊娠母豬帶毒綜合征，新生仔豬免疫耐受和隱形持續(xù)性感染為主，給養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。福建省為中國的養(yǎng)豬大省，養(yǎng)豬業(yè)已成為當(dāng)?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)，通過對福建省規(guī)?；i場CSFV的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)CSFV的流行毒株從1.1亞型為主逐漸演化到 2.1b亞型為主[6]，因此本研究對福建省一株處于2.1b亞群的CSFV株進(jìn)行全基因克隆和序列測定，以獲得CSFV比較全面的數(shù)據(jù)和信息，從而為預(yù)防控制豬瘟提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2014年8月在在福建省龍巖市某規(guī)模化豬場無菌采集疑似CSF豬的脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、扁桃體等，將病料放至-70℃凍存?zhèn)溆?。PK-15細(xì)胞由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗室保存。

1.1.2 主要試劑 HRRI DNA酶抑制劑(40 U/μL)、M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、DNA Marker 2000、pMD19-T克隆載體,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 根據(jù)GenBank公布的CSFV毒株全基因組序列，參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計合成11對引物用于CSFV病毒株全基因組序列擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長度最長為948～1555 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 CN-CN-FJLY全基因的引物序列

1.2.2 病毒分離 將處理過的病料上清液接種于長成單層的PK-15細(xì)胞，PBS清洗后加入DMEM維持液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的條件下培養(yǎng)3 d～4 d后，凍融3次。取300 μL混合液接種PK-15細(xì)胞繼續(xù)盲傳3代，收取病毒液，置-80℃保存。

1.2.3 CSFV全基因各個片段RT-PCR 提取病毒液的RNA，參考Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板通過PCR方法分段擴(kuò)增CSFV基因組。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆與測序 PCR產(chǎn)物的純化與回收按照天根生化科技有限公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行。連接反應(yīng)按pMD19-T載體連接試劑盒說明書進(jìn)行，將鑒定為陽性的重組菌液送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5 序列分析 采用DNAStar Lasergene 7.1程序中的CLUSTAL W程序進(jìn)行多序列比對。用MEGA 6.0軟件中的鄰近法(neighbor-joining tree with 1000 bootstrap)對CSFV基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。本研究所用的參考序列見表2。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)病毒的分離培養(yǎng)，獲得一株CSFV，將其命名為CN-FJLY。應(yīng)用RT-PCR方法分為11個片段對福建省分離的一株豬瘟流行毒株全基因進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示11個擴(kuò)增片段與預(yù)期目的片段大小一致，擴(kuò)增片段為952 bp～1 555 bp(圖1)。

表2 22株CSFV參考毒株的信息

2.2 目的基因的序列測序與分析

將CN-FJLY毒株的各片段測序結(jié)果進(jìn)行拼接，結(jié)果顯示毒株基因組全長為12 296 bp(登錄號：MF679604 )。為了進(jìn)一步分析CN-FJLY毒株的基因組特性，將CN-FJLY毒株的各基因(Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)及非編碼區(qū)(5′UTR和 3′UTR)與參考株 (HCLV、Shimen、SXCDK、HEBZ、GXWZ02、HNLY-2011和Zj0801)進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列較分析。結(jié)果顯示，CN-FJLY毒株的全基因組與處于2.1b亞群的HEBZ和GXWZ02同源性最高，為95.1%～97.0%，與處于1.1亞群的HCLV和Shimen的同源性最低，為81.5%～83.7%(表3)。與參考毒株相比，CN-FJLY毒株變異程度較大的是5′UTR、E2、P7、NS2、NS5A和3′UTR(表3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ; 1.陰性對照;2～12.全基因各片段PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000 ; 1.Negative control; 2-12.PCR products of complete genome of CSFV

HCLV(1.1)Shimen(1.1)SXCDK(2.1a)HEBZ(2.1b)GXWZ02(2.1b)HNLY-2011(2.1c)Zj0801(2.1d)Full genome84.485.393.094.397.092.394.25'UTR91.992.295.494.494.693.593.83'UTR83.384.594.696.095.594.698.2Npro85.587.392.994.497.691.395.293.593.597.095.8100.094.697.6C84.884.894.692.996.393.993.991.992.996.097.097.094.998.0Ems83.084.092.594.397.593.194.389.089.996.997.899.698.799.1E184.686.291.893.897.492.694.090.894.995.496.998.596.996.9E281.182.891.594.896.090.795.287.789.594.996.897.396.096.5P779.077.692.993.397.693.893.388.688.694.392.995.794.392.9NS283.483.590.793.395.490.792.990.289.995.095.896.795.094.1NS386.587.794.995.297.493.895.097.298.599.799.099.399.098.7NS4A89.487.995.595.598.092.993.997.098.598.598.5100.097.0100.0NS4B85.986.792.592.696.889.992.694.396.098.398.399.198.698.6NS5A82.084.291.093.796.691.293.486.587.994.995.897.493.995.6NS5B84.384.494.194.998.093.194.591.891.295.896.599.296.996.8

注：粗體為核苷酸同源性，斜體為氨基酸同源性。

Noet:Bold is nucleotide homology and italic is amino acid homology.

2.3 遺傳進(jìn)化分析

將CN-FJLY株CSFV的全基因組序列及E2基因分別與22株國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比對，并建立系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹?；贑SFV全基因組序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹表明，CN-FJLY毒株與GXWZ02、HEBZ等毒株處于同一進(jìn)化樹分支，為2.1b亞群(圖2)?；贓2基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹的分析結(jié)果與全基因組的分析結(jié)果一致(圖3)。

圖2 CSFV全基因組核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹

圖3 CSFV E2基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹

2.4 E2基因推導(dǎo)氨基酸序列分析

CSFV E2基因推導(dǎo)氨基酸序列分析表明，CN-FJLY株與疫苗株HCLV相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)相比，有45個氨基酸突變位點(diǎn)。研究表明，B/C區(qū)域中第705、710、713、729、734等位點(diǎn)氨基酸的變異將導(dǎo)致毒株逃脫與特定單抗的免疫反應(yīng)，CN-FJLY在713、725、729、734和738氨基酸位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替換(圖4)。

圖4 CSFV E2基因氨基酸序列分析

3 討論

研究表明，HCLV疫苗株在堿基組3′-NTR含有一段富含T的13個連續(xù)堿基的插入序列，CN-FJLY株不存在這樣的分子標(biāo)記，表明該毒株是一株CSFV野毒株[8-9]。根據(jù)CSFV基因組的5′-UTR、E2以及NS5B序列的差異性，豬瘟病毒可被分為3個基因型11個基因亞型(1.1～1.4、2.1～2.3、3.1～3.4)[10-11]，2.1亞型進(jìn)一步分為2.1a、2.1b、2.1c、2.1d[12-14]。豬瘟兔化弱毒疫苗株處于1.1亞群，雖然弱毒疫苗的廣泛使用使豬瘟的危害得到了有效的控制，但是豬瘟在我國時有發(fā)生，對我國養(yǎng)豬業(yè)仍然造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失。分子流行病學(xué)調(diào)查表明福建省CSFV的流行毒株從1.1亞型為主逐漸演化到2.1b亞型為主。為了進(jìn)一步明確2.1b亞型CSFV毒株的分子流行病學(xué)特征，本研究對福建省CN-FJLY進(jìn)行了全基因組序列的測定及分析，以期為CSF的防控提供依據(jù)。

CN-FJLY毒株全基因組與參考毒株進(jìn)行全基因組及各個基因的同源性分析，結(jié)果表明CN-FJLY毒株核苷酸同源性與2.1b亞群的 GXWZ02毒株最高，為97.0%，而與屬于1.1亞群的Shimen株、HCLV株核苷酸同源性分別為85.3%、84.4%；基于CSFV全基因組和E2基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也表明，CN-FJLY與GXWZ02、HEBZ等親緣關(guān)系較近，屬于2.1b亞群，與處于1.1亞群的疫苗毒株HCLV和Shimen毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明福建省豬瘟病毒流行毒株正向遠(yuǎn)離疫苗株方向變異，這種變異是否導(dǎo)致豬瘟兔化弱毒疫苗株對CN-FJLY毒株保護(hù)力不全，從而使CSFV不完全免疫或免疫失敗，有待進(jìn)一步研究驗證。各基因的同源性比較結(jié)果顯示，與HCLV相比CN-FJLY的Ems、E2、P7、NS2和NS5A變異較大，非編碼區(qū) 3′UTR的變異程度高于5′UTR。研究表明，CSFV E2蛋白中位于713-719位有一段較為保守的序列GGLTTTW，該序列對蛋白抗原性的產(chǎn)生有非常重要的作用。在測定的序列中，CN-FJLYFJLY毒株在713位發(fā)生了G→E變異。CSFV E2基因在第705、710、713、725、729、734、738位等氨基酸位點(diǎn)的改變，會致使豬瘟毒株逃脫與特定單抗的免疫反應(yīng)，CN-FJLY在713、725、729、734、738氨基酸位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替換，可能會導(dǎo)致CSFV流行毒逃脫兔化弱毒疫苗的免疫保護(hù)，從而引起免疫失敗[15]。

綜上所述，福建省處于2.1b亞群的CSFV流行毒株與中國標(biāo)準(zhǔn)參考參考毒株Shimen、HCLV疫苗株存在較大差異，豬瘟兔化疫苗是否能對其起到完全的免疫保護(hù)，需要進(jìn)一步研究。同時需要實(shí)時監(jiān)控福建省各個地區(qū)豬瘟流行毒株的遺傳特性，從而全面的了解福建省整體豬瘟的流行形勢，為防控豬瘟提供理論依據(jù)。