朱小甫,吳旭錦

(咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽(yáng) 712000)

近年來(lái)，在我國(guó)雞群中出現(xiàn)了一種被稱為“心包積液-肝炎綜合征”的疾病，經(jīng)過(guò)初步研究，認(rèn)為該病是由Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)引起[1-3]。目前已知Ⅰ群禽腺病毒分為A～E共5個(gè)種，每個(gè)種內(nèi)的病毒根據(jù)交叉中和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分為12個(gè)血清型。病毒粒子直徑70 nm～90 nm，無(wú)囊膜，呈20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，對(duì)脂溶劑有抵抗力，耐受pH 3～9[4]。Ⅰ群禽腺病毒既能水平傳播，又能垂直傳播，與該病毒有關(guān)的疾病有包涵體肝炎、心包積液綜合征、肌胃糜爛癥和心包積液-肝炎綜合征，還有報(bào)道該病毒能導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降、飼料報(bào)酬下降以及呼吸道疾病[5-7]。研究表明，這些不同的臨床表現(xiàn)由不同的血清型引起[8-12]。Ⅰ群禽腺病毒六鄰體是主要的衣殼蛋白，由hexon基因編碼，含有型、群和亞群特異性抗原決定簇，與致病性密切相關(guān)。hexon基因全長(zhǎng)2 829 bp，編碼943個(gè)氨基酸，用hexon基因可區(qū)分特定的血清型[13]。為調(diào)查雞群Ⅰ群禽腺病毒感染情況，并分析病原血清型分布特點(diǎn)，咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室采集了2015年-2016年間疑似病例樣品，進(jìn)行了hexon基因序列分析，為Ⅰ群禽腺病毒的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織病料 采集自疑似病例蛋雞場(chǎng)或肉雞場(chǎng)，主要采集脾臟和肝臟，取適量組織加滅菌PBS剪碎，研磨破碎細(xì)胞后12 000 r/min離心10 min，收集上清液置-70℃保存?zhèn)溆?。樣品?lái)自陜西、甘肅和山西部分地區(qū)雞場(chǎng)。

1.1.2 試劑 DNAiso核酸提取試劑、rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTP(2.5 mmol/L)、pMD18-T載體克隆試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DH5ɑ大腸埃希菌由動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank上FAdV基因序列NC001720、EU979370、GU188428，針對(duì)FAdV六鄰體hexon基因設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)引物，F(xiàn)AdV-1F：5′-TCAACCACCACCGTAACTG-3′(19802-19820)；FAdV-1R：5′-GGGAGTTGTTTGTGTACAT-3′(20956-20938)； FAdV-2F：5′-CACTTACGAGTGGGTCCTCAGA-3′(19935-19956)；FAdV-2R：5′-CCGGTGTCGTTAACAACG-3′(20684-20667)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，均用DEPC處理水稀釋到20 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 病料中總DNA的提取 吸取處理好的組織病料上清液200 μL置于無(wú)菌EP管，加入DNAiso Reagent 800 μL，上下顛倒混勻，室溫靜置裂解10 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，吸取800 μL上清液轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌EP管，加入600 μL冰冷無(wú)水乙醇沉淀10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入1 mL冰冷的700 mL/L乙醇清洗2次，倒置干燥，用40 μL 8 mmol/L NaOH充分吹打溶解，即得總DNA溶液。

1.2.2 套式PCR擴(kuò)增hexon基因 第1次擴(kuò)增按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行：DNA溶液 2.0 μL，超純水17.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，F(xiàn)AdV-1F/FAdV-1R各0.5 μL，rTaq酶0.5 μL，總體積25.0 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 50 s，53℃ 60 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取第1次擴(kuò)增產(chǎn)物2.0 μL作為模板進(jìn)行第2次擴(kuò)增，體系同第1次擴(kuò)增，引物為FAdV-2F/FAdV-2R。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 40 s，58℃ 45 s，72℃ 45 s 35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取5.0 μL第2次擴(kuò)增產(chǎn)物，15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及測(cè)序 對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，操作按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Amp篩選，挑取單個(gè)菌落，37℃搖動(dòng)培養(yǎng)至飽和，菌液PCR鑒定為陽(yáng)性，送陽(yáng)性菌液至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測(cè)序。

1.2.4 hexon基因序列分析 共獲得了8株Hexon基因序列，用DNA Star軟件將流行毒株與參考毒株進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性比較分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。參考毒株信息如下：CELO，GenBank登錄號(hào)Z67970，F(xiàn)AdV-1型；SR48，GenBank登錄號(hào)EU979368，F(xiàn)AdV-2型；SR49，GenBank登錄號(hào)EU979369，F(xiàn)AdV-3型；ON1，GenBank登錄號(hào)GU188428，F(xiàn)AdV-4型；340，GenBank登錄號(hào)AF508952，F(xiàn)AdV-5型；CR119，GenBank登錄號(hào)EU979372，F(xiàn)AdV-6型；YR36，GenBank登錄號(hào)EU979373，F(xiàn)AdV-7型；TR59，GenBank登錄號(hào)EU979374，F(xiàn)AdV-8a型；764，GenBank登錄號(hào)JN112373，F(xiàn)AdV-8b型；A02，GenBank登錄號(hào)EU979376，F(xiàn)AdV-9型；GenBank登錄號(hào)AY683551，F(xiàn)AdV10型 ；UF71，GenBank登錄號(hào)EU979378，F(xiàn)AdV11型；GenBank登錄號(hào)AY683553，F(xiàn)AdV12型； Kr-Yeoju，GenBank登錄號(hào)HQ709228；PP-01 GenBank登錄號(hào)EU938324；SDSX，GenBank登錄號(hào)KT899325。

2 結(jié)果

2.1 hexon基因套式PCR擴(kuò)增

從采集的組織中成功擴(kuò)增出了hexon基因片段，長(zhǎng)度為750 bp，與預(yù)期大小相符(圖1)。先后獲得了8株病毒hexon基因，分別是HM株(陜西商洛市，蛋雞場(chǎng))、SXFS株(山西繁峙縣，肉雞場(chǎng))、LQQD株(陜西禮泉縣，肉雞場(chǎng))、HXGB株(陜西戶縣，蛋雞場(chǎng))、GSPL株(甘肅平?jīng)?，蛋雞場(chǎng))、DYQY株(陜西大荔縣，蛋雞場(chǎng))、FP株(陜西富平縣，肉雞場(chǎng))和GS株(甘肅武威，蛋雞場(chǎng))。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～4.部分FAdV陽(yáng)性組織hexon基因擴(kuò)增

M.DNA Marker DL 2 000; 1-4.FAdV hexon gene amplification

圖1 hexon基因套式PCR擴(kuò)增電泳圖

Fig.1 Electrophoresis of nested PCR amplification of hexon gene

2.2 hexon基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建

將所測(cè)定的8株序列和16株參考序列導(dǎo)入DNA Star軟件，采用MegAlign比較分析，繪制出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)測(cè)定毒株進(jìn)行分型，能夠直觀的表示毒株之間的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可見(jiàn)，參比毒株分為兩個(gè)大群，1、4、10、12血清型組成一個(gè)大的分支，2、3、5、6、7、8a、8b、9、112血清型組成另一個(gè)大的分支。測(cè)定的流行毒株中，HM、SXFS、LQQD、HXGB、GSPL、DYQY、FP與FAdV-4型的ON1、PP-01、SDSX 、Kr-Yeoju株親緣關(guān)系最近，因此這7株均屬于FAdV-4型。GS與CELO株親緣關(guān)系最近，屬于FAdV-1型。

2.3 hexon基因核苷酸、氨基酸序列比較分析

由于獲得的8個(gè)流行毒株分別屬于FAdV-4型和FAdV-1型，因此選擇相應(yīng)參考毒株ON1、PP-01、SDSX、Kr-Yeoju和CELO株進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列比對(duì)分析，同源性結(jié)果見(jiàn)表1。

表1中，屬于FAdV-4型的HM、SXFS、LQQD、HXGB、GSPL、DYQY、FP、ON1、PP-01、SDSX和Kr-Yeoju株核苷酸同源性在98.9%～100%之間，最低的是SDSX和Kr-Yeoju株，同源性為98.9%。測(cè)定的7株FAdV-4型流行毒株中，DYQY與FP核苷酸同源性為100%，GSPL、HM、HXGB、LQQD和SXFS之間核苷酸同源性為100%，DYQY與GSPL核苷酸同源性為99.9%。測(cè)定的7株FAdV-4型流行毒株推導(dǎo)氨基酸序列同源性均為100%，提示這7株FAdV-4型流行毒株高度同源。屬于FAdV-1型的GS與CELO株核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列同源性均為99.2%，提示GS與CELO株親緣關(guān)系較高。

推導(dǎo)氨基酸序列分析顯示，在測(cè)定的250個(gè)氨基酸中，參比的FAdV-4型11個(gè)毒株僅有1個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，即第60位ON1和韓國(guó)Kr-Yeoju株為纈氨酸，而測(cè)定的7個(gè)流行毒株、山東鴨源SDSX株以及印度PP-01株均為異亮氨酸。FAdV-1型的GS與CELO株存在2個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，即第60位、149位CELO為纈氨酸和甘氨酸，而GS株分別為丙氨酸和絲氨酸。

圖2 基于hexon基因繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

%

注：右上角為核苷酸同源性，左下角為氨基酸同源性。1～13.分別為DYQY、ON1、CELO、FP、GS、GSPL、HM、HXGB、Kr-Yeoju、LQQD、PP-01、SDSX、SXFS株。

Noet:The upper right corner is the nucleotide homology,the lower left corner is the amino acid homology.1-13. DYQY,ON1,CELO,FP,GS,GSPL,HM,HXGB,Kr-Yeoju,LQQD,PP-01,SDSX,SXFS strains.

3 討論

從2015年起，我國(guó)雞群中流行一種以心包積液和肝臟腫大的疾病，被稱為心包積液-肝炎綜合征[1,5]。咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在陜西及周邊地區(qū)雞群中同樣存在類似疾病。剖檢發(fā)現(xiàn)，主要病變?yōu)楦闻K腫大，顏色變淡，為黃色或黃褐相間，質(zhì)地變脆；心臟心包腔中有或多或少的淡黃色透明積液，心肌松弛；腎臟腫大呈花斑狀；肌胃腺胃交界處有條帶狀出血。劉東等[5]研究認(rèn)為，目前國(guó)內(nèi)Ⅰ群腺病毒主要有2個(gè)血清型，臨床表現(xiàn)包涵體肝炎的為FAdV-8a/b型，表現(xiàn)為心包積液綜合征的為FAdV-4型。牛登云等[12]通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，2015年國(guó)內(nèi)主要流行Ⅰ群禽腺病毒C和E兩種基因型，4和8b兩種血清型。通過(guò)本課題組設(shè)計(jì)的Ⅰ群禽腺病毒通用nPCR方法，直接從病變組織中獲得了hexon基因片段，測(cè)序分析表明，獲得的8個(gè)流行毒株中，HM、SXFS、LQQD、HXGB、GSPL、DYQY和FP株屬于FAdV-4型，僅有GS株屬于FAdV-1型。結(jié)果提示引起心包積液-肝炎綜合征的主要病原為Ⅰ群禽腺病毒FAdV-4型，同時(shí)存在FAdV-1型，肉雞場(chǎng)和蛋雞場(chǎng)中均有發(fā)生。FAdV-4型是流行毒株的優(yōu)勢(shì)血清型，這與劉東等[5]、牛登云等[12]的研究結(jié)論一致，但FAdV-1型感染引起心包積液-肝炎綜合征尚未見(jiàn)到類似報(bào)道。

核苷酸序列比對(duì)分析表明，7個(gè)FAdV-4型毒株中，核苷酸同源性為99.9%～100%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性均為100%。與參考毒株相比較，僅有第60位ON1株和韓國(guó)Kr-Yeoju株為纈氨酸，而測(cè)定的7個(gè)流行毒株、山東鴨源SDSX株以及印度PP-01株均為異亮氨酸，我國(guó)毒株與韓國(guó)、印度等國(guó)外毒株同源性很高，結(jié)果提示這些流行毒株高度同源，推測(cè)在免疫原性上差異很小。FAdV-1型的GS與CELO株核苷酸、推導(dǎo)的氨基酸序列同源性均為99.2%，僅存在2個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，第60位、149位CELO為纈氨酸和甘氨酸，而GS株分別為丙氨酸和絲氨酸，提示GS與CELO株親緣關(guān)系較高。本研究通過(guò)Ⅰ群禽腺病毒的基因分型和hexon基因序列分析，為進(jìn)一步進(jìn)行病毒分離、病毒生物學(xué)特性研究奠定了基礎(chǔ)。