王建兵，劉二軍，張偉玲，趙甫剛

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院 中醫(yī)科，河北 石家莊 050031)

胃潰瘍是臨床常見疾病，其發(fā)生主要與胃黏膜損傷和機體自身免疫防御機制失衡有關(guān)[1- 4]。近年來研究表明，針灸能夠減緩胃黏膜損傷并促進其修復，有效地調(diào)節(jié)機體的免疫功能，促進潰瘍面愈合，針灸胃經(jīng)穴位能夠防治胃黏膜損傷[5]。研究發(fā)現(xiàn)，“足三里”是足陽明胃經(jīng)的主要穴位之一，電針刺“足三里”能增加血漿和胃體黏膜中降鈣素基因相關(guān)肽的含量[6]。另有研究表明，電針刺“梁門穴”對胃潰瘍愈合率最高[7]。健中愈瘍片主要由黨參、白術(shù)、黃芪、救必應、延胡索、蒲公英、珍珠粉、甘草等組成，能夠提高胃潰瘍愈合率，降低炎癥因子水平，具有改善胃潰瘍愈合質(zhì)量的作用[8- 9]。本研究探討電針聯(lián)合灌服健中愈瘍片對乙酸誘導胃潰瘍大鼠下丘腦與血漿β- 內(nèi)啡肽及血清中細胞炎癥因子水平的影響，探討兩種方法聯(lián)合使用對胃潰瘍的療效及其保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 β- 內(nèi)啡肽酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒(美國TSZ公司生產(chǎn))；白細胞介素- 6(IL- 6)、白細胞介素- 8(IL- 8)、腫瘤壞死因子- α(TNF- α)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(德國IBL公司生產(chǎn))；健中愈瘍片(九芝堂股份有限公司生產(chǎn))；戊巴比妥鈉(北京沃比森科技有限公司)；肝素(上海昊化化工有限公司)；乙醇分析純，水為超純水。G6805- 2治療儀(青島鑫升實業(yè)有限公司)；多功能酶標儀(上海沛歐分析儀器有限公司)；-80 ℃冰箱(北京華興科儀科技發(fā)展有限公司)；低溫離心機(四川蜀科儀器有限公司)。

1.1.2 實驗動物 SPF清潔級SD雄性大鼠50只，體重(200±20) g，4周齡，由河北省實驗動物中心提供。室溫(23±2) ℃，相對濕度58%，自由飲水和喂食，適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 胃潰瘍動物模型的制備 大鼠于造模前禁食12 h，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(2 ml·kg-1)麻醉，腹壁剪毛，消毒，于劍突下縱向切開腹壁約2 cm，在胃前壁體竇交接處漿膜面用乙酸(假手術(shù)組大鼠以生理鹽水代替乙酸)浸泡過的5 mm濾紙緊貼2次，30 s·次-1，用生理鹽水沖洗，分層縫合腹壁，注射抗生素。

1.2.2 動物分組與給藥[10]將大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組，即假手術(shù)組、模型組、電針組、藥物組和聯(lián)合組，每組10只。各組大鼠按照“1.2.1”項下方法造模。其中假手術(shù)組大鼠未進行乙酸濾紙刺激，其他操作相同。電針組與聯(lián)合組穴分別選雙側(cè)足三里和梁門穴，接電極，連接治療儀(頻率2 Hz，強度3 V，波寬1 ms)，持續(xù)30 min，每天1次，連續(xù)2周。藥物組與聯(lián)合組灌胃給予健中愈瘍片0.5 g·kg-1(按成人給藥量的大鼠體表面積換算后的劑量)，每天1次，連續(xù)2周。假手術(shù)組與模型組于每天給予等量生理鹽水。

1.2.3 樣本的采集及指標測定 各組大鼠禁食24 h后，斷頭取血、取胃。血液分別置于肝素抗凝和不含肝素的離心管中，于4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min，分別收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存，分別用于測定血漿β- 內(nèi)啡肽和IL- 6、IL- 8、TNF- α的含量。處死大鼠后冰臺上迅速分離下丘腦，稱重，加入1 mol·L-1鹽酸1 ml，制成勻漿，室溫放置100 min充分溶解生物活性肽，加入1 mol·L-1氫氧化鈉1 ml中和，于3 500 r·min-1離心10 min，取上清液，用于測定下丘腦β- 內(nèi)啡肽。沿胃大彎剪開，取胃，以生理鹽水沖洗，用游標卡尺測定潰瘍灶大小，采用Guth法計算黏膜損傷指數(shù)[11]和潰瘍抑制率，潰瘍抑制率(%)=[1-(實驗組潰瘍指數(shù)均值/模型組潰瘍指數(shù)均值)]×100%。以潰瘍灶的最長徑為中心切取含潰瘍邊緣約3 mm胃組織，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，置于載玻片上進行HE染色。

1.2.4 下丘腦與血漿β- 內(nèi)啡肽的測定 按照ELISA試劑盒說明書進行操作，加入100 μl標準品、100 μl“1.2.3”項下制得樣本于相應反應板孔中，混勻，封孔，37 ℃孵育約90 min，洗板，生物素及辣根過氧化物酶溫育，顯色后于多功能酶標儀450 nm處讀吸光度，計算含量。

1.2.5 IL- 6、IL- 8、TNF- α的檢測 按照ELISA試劑盒使用說明書操作，方法同“1.2.4”項，用多功能酶標儀450 nm下進行檢測，測定吸光度，計算含量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠胃黏膜病理組織觀察

與假手術(shù)組小鼠比較，模型組胃潰瘍面積明顯，黏膜層薄，缺損嚴重，下層可見大量炎性細胞浸潤(P<0.05)。電針組、藥物組和聯(lián)合組胃黏膜損傷明顯修復，黏膜層較厚，炎性細胞明顯較少(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠潰瘍指數(shù)的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Guth潰瘍損傷指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，電針組、藥物組和聯(lián)合組大鼠Guth潰瘍損傷指數(shù)顯著降低(P<0.05)。聯(lián)合組大鼠的Guth潰瘍損傷指數(shù)比電針組和藥物組低(P<0.05)，潰瘍抑制率比電針組與藥物組高(P<0.05)。電針組、藥物組大鼠Guth潰瘍損傷指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

組 別n炎性細胞浸潤數(shù)量假手術(shù)組109.52±1.36模型組1040.53±8.36a電針組1028.52±5.75bc藥物組1023.75±4.59bc聯(lián)合組1018.52±3.75b

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聯(lián)合組比較，cP<0.05

組 別nGuth潰瘍損傷指數(shù)潰瘍抑制率/%假手術(shù)組100—模型組1051.15±8.34a—電針組1011.63±1.84bc77.27c藥物組109.68±1.37bc82.08c聯(lián)合組105.64±1.76b88.98

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聯(lián)合組比較，cP<0.05

2.3 各組大鼠血漿中β- 內(nèi)啡肽含量的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿β- 內(nèi)啡肽含量顯著降低，下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，電針組和聯(lián)合組大鼠血漿β- 內(nèi)啡肽含量顯著上升，下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量顯著下降(P<0.05)。 聯(lián)合組大鼠下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量比電針組和藥物組低(P<0.05)，電針組大鼠下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量比藥物組低(P<0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠血清IL- 6、IL- 8、TN F- α含量的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，電針組、藥物組和聯(lián)合組大鼠血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量顯著降低(P<0.05)。聯(lián)合組大鼠血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量比電針組和藥物組低(P<0.05)。藥物組大鼠血清IL- 6、TNF- α含量比電針組低(P<0.05)，兩組IL- 8含量不存在顯著差異。見表4。

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聯(lián)合組比較，cP<0.05

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聯(lián)合組比較，cP<0.05

3 討 論

引起胃潰瘍的因素主要有胃酸過多、胃黏膜保護作用減弱和Hp感染，其中Hp感染是引起胃潰瘍發(fā)生的最主要原因[12]。Hp作為一種革蘭陰性桿菌，導致機體在應激狀態(tài)下發(fā)生炎癥反應，引起IL- 6、IL- 8等炎性細胞因子含量上升，使下丘腦調(diào)控作用發(fā)生障礙，導致胃黏膜免疫系統(tǒng)紊亂，損傷胃組織，引發(fā)胃黏膜屏障受損及病變。β- 內(nèi)啡肽為阿片肽類免疫活性物質(zhì)，主要產(chǎn)生于下丘腦和垂體，當機體受到應激刺激后其水平發(fā)生變化，對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)具有較強的調(diào)節(jié)作用，其作用機制主要通過調(diào)節(jié)炎性細胞因子的表達來完成[13]。

電針主要通過調(diào)節(jié)垂體- 下丘腦- 腎上腺軸，使代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)而產(chǎn)生療效。足三里穴和梁門穴為足陽明胃經(jīng)的代表穴，足三里穴為足陽明胃經(jīng)的合穴和胃的下合穴，能提高機體免疫，是目前胃潰瘍臨床治療應用最廣、研究最多的一個穴位。梁門穴位于胃竇部，是胃部局部病變的首選穴位之一，對胃腑功能的寒熱虛實疾病包括腹痛、泄瀉、消化性潰瘍等具有療效，為足陽明胃經(jīng)經(jīng)氣出入的重要門戶，使胃腑功能受納、腐熟水谷功能得以改善。足三里、梁門穴均為足陽明胃經(jīng)穴，足三里穴配伍梁門穴，既重視局部，又不忽略整體，達到調(diào)和脾胃、暢通氣機的功效，電針刺二穴對治療胃潰瘍具有顯著療效[14]。健中愈瘍片由黨參、黃芪、白芍、延胡索等中藥組成，方中黨參、黃芪具有健脾益氣的作用，能夠增強吞噬細胞的吞噬作用，增強抗炎作用；白芍柔肝止痛，能夠降低炎癥因子分泌，減少炎癥反應，促進胃黏膜組織修復；延胡索具有活血行氣止痛的作用，能夠抑制胃酸分泌。

本次實驗觀察了胃潰瘍模型大鼠血漿與下丘腦β- 內(nèi)啡肽和炎性細胞因子IL- 6、IL- 8、TNF- α的含量變化情況，結(jié)果表明，模型組下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量顯著高于假手術(shù)組，主要原因是模型組大鼠注射乙酸后，在應激狀態(tài)下啟動防御機制，通過激活下丘腦- 垂體- 腎上腺軸促進促腎上腺皮質(zhì)激素及β- 內(nèi)啡肽的釋放，導致胃潰瘍大鼠模型下丘腦中β- 內(nèi)啡肽含量升高。電針與藥物單獨治療、聯(lián)合治療均能顯著降低胃潰瘍小鼠下丘腦中β- 內(nèi)啡肽含量和血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量，升高血漿中β- 內(nèi)啡肽含量，兩種方法結(jié)合療效更顯著。下丘腦β- 內(nèi)啡肽與血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量呈正相關(guān)，說明下丘腦β- 內(nèi)啡肽的含量下降，通過調(diào)節(jié)機體免疫平衡抑制細胞炎癥因子的合成，并使其水平下降，修復失衡的免疫功能，保護胃黏膜。電針刺足三里和梁門穴治療可以有效降低下丘腦β- 內(nèi)啡肽水平，增加血漿β- 內(nèi)啡肽含量，使下丘腦β- 內(nèi)啡肽向血漿釋放，與文獻報道[15]結(jié)果一致。健中愈瘍片組方中多種中藥配伍起協(xié)同作用，通過調(diào)節(jié)免疫平衡發(fā)揮抗炎作用，促進消化道修復，針對胃潰瘍的病因起綜合療效。電針治療能夠降低下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量，健中愈瘍片可有效抑制IL- 6、IL- 8、TNF- α的表達，電針與健中愈瘍片聯(lián)合使用共同促進機體免疫功能平衡調(diào)節(jié)，可有效降低胃黏膜組織損傷，發(fā)揮治療胃潰瘍的作用。