陳華濤，瞿紫微，孟慶彬，肖新波，趙春翔

(武漢市第一醫(yī)院 胃腸外科，湖北 武漢 430022)

結直腸癌已經成為僅次于肺癌和乳腺癌的第3種對人類健康造成嚴重威脅的常見惡性腫瘤[1]。我國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年升高，且約20%的患者會發(fā)生癌癥的轉移[2]。血管生成擬態(tài)是近年來在部分惡性實體腫瘤中提出的一種新型供血循環(huán)系統(tǒng)，其存在對腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移等具有重要調節(jié)作用[3]。結直腸癌中血管生成擬態(tài)已經被證實，且發(fā)生血管生成擬態(tài)的腫瘤具有更強的增殖和轉移侵襲能力[4]。血管上皮鈣黏附素(vascular endothelial cadherin, VE- cadherin)、基質金屬蛋白酶- 2(matrix metalloproteinase 2, MMP- 2)和粘連蛋白5γ2鏈(laminin5γ2,LN- 5γ2)的表達對腫瘤細胞血管生成擬態(tài)具有重要調節(jié)作用[5]。Krüppel樣因子(Krüppel like factors，KLFs)是一類在羧基端有3個C2H2鋅指結構，具有調節(jié)細胞分化、增殖以及凋亡的轉錄因子[6]。已有研究證實，KLF17通過調節(jié)腫瘤細胞的增殖和分化參與多種上皮性腫瘤的發(fā)生，調節(jié)腫瘤細胞的侵襲和轉移[7]。本研究通過檢測轉染KLF17過表達質粒后人結直腸癌細胞SW480中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的基因和蛋白表達水平以及SW480細胞體外侵襲能力，探究KLF17對結直腸癌細胞血管生成擬態(tài)以及體外侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SW480細胞由本實驗室提供，PIRES- EGFP質粒購自武漢華聯(lián)科生物公司，KLF17重組表達質粒PIRES- EGFP- KLF17由本實驗室自行構建。胎牛血清和DMEM完全培養(yǎng)基購自南京建成生物工程研究所。Trizol購自北京艾德萊生物公司，逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自TAKARA公司。KLF17抗體購自Santa Cruz公司，LN5γ2、VE- cadherin、MMP- 2抗體分別購自Chemicon公司、R&D公司、Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SW480細胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于95%O2、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至貼壁后使用0.3%胰酶消化和傳代。

1.3 基因轉染實驗

采用電轉法將PIRES- EGFP- KLF17轉入SW480細胞。在轉染之前使用0.3%胰酶消化細胞，顯微鏡下調整細胞濃度至1×105個·μl-1。將PIRES- EGFP- KLF17以及細胞懸液加入4 mm電轉杯中，混合均勻后冰浴10 min。電轉條件為450 V電壓、500 mu電容。電轉結束，再冰浴10 min，然后將細胞轉至每孔含1 ml DMEM培養(yǎng)液的24孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以未轉染重組質粒的SW480細胞作為對照。

1.4 Real- time qPCR檢測mRNA的表達水平

收集轉染重組質粒后培養(yǎng)12、24、48和72 h的細胞，用Trizol裂解液裂解細胞并進行細胞總RNA的提取，使用反轉錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行單鏈cDNA的合成。采用Primer Premier 5.0進行熒光定量PCR，引物由天一輝遠生物公司設計合成，引物序列見表1。熒光定量PCR反應體系為：2×SYBR Premix Ex TaqTM 9 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，cDNA溶液1 μl，DEPC H2O 9 μl；95 ℃預變性30 s；95 ℃ 20 s， 60 ℃ 15 s， 72 ℃ 20 s， 40 個循環(huán)。定量結果使用△△Ct法處理。

表1qPCR引物序列

基 因上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') KLF17TAGTAAAGGGGATGGT-GCGACTCACACCCTAGCCAAAGCCVE-cadherinCTGTCTACTCTTATCCCTT-GGTTTGTCAGTGTATCTACATCCT-GAMMP-2GGCATCCAGGTTATCGGGGACCATGTACGTTGCTATC-CAGGLN-5γ2GATCGAGAATCCTGACATT-GAGGAGCTGATATCTGAATCT-CACGAPDHCGACCACTTTGTCAAGCTCAAGGGGTCTACATG-GCAACTG

1.5 Western blotting 檢測蛋白表達水平

取轉染重組質粒后培養(yǎng)48 h的細胞進行總蛋白的提取，使用BCA kit對蛋白進行定量。每組取30 μg蛋白進行SDS- PAGE電泳，將表達產物轉移至PVDF膜上，隨后將封閉后的膜用一抗4 ℃孵育過夜。最后將膜用緩沖液沖洗2次，并用二抗在室溫條件下孵育2 h。

1.6 轉染前后細胞侵襲能力的檢測

將50 μl Matrigel和150 μl RPMI 1640培養(yǎng)基加入到Transwell小室濾膜中，待細胞生長至對數(shù)生長期時使用胰酶消化，使用RPMI 1640培養(yǎng)基對細胞進行重懸并調整細胞濃度為1×105個·ml-1。Transwell小室上室中接種10 μl細胞懸液，下室加入等量常規(guī)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛對細胞進行固定后行Gimsa染色，最后在顯微鏡下觀察轉移細胞并進行計數(shù)和拍照。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 KLF17表達水平變化

KLF17轉染SW480細胞24 h開始KLF17 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.01，圖1A)，說明KLF17已經成功轉染入SW480細胞中且能夠正常表達。重組質粒轉染48 h后KLF17蛋白表達水平與基因表達水平是相符的，顯著高于對照組(P<0.01,圖1B)，進一步說明了KLF17成功轉入SW480細胞，并能夠正常表達。

與對照組相比，aP<0.01

圖1轉染后SW480細胞KLF17表達量變化

2.2 血管生成擬態(tài)相關基因的表達

與對照組相比，轉染KLF17后結直腸癌細胞SW480中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的mRNA表達水平在24 h開始顯著降低(P<0.01，圖2)。Western blotting結果顯示，轉染KLF17 48 h后SW480細胞中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的蛋白表達水平顯著低于對照組，與48 h時mRAN表達水平一致(圖3)。

2.3 KLF17基因轉染對SW480細胞侵襲能力的影響

Transwell結果表明48 h后實驗組和對照組均有細胞穿出微孔濾膜(圖4)。對照組和實驗組顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)分別為(135.33±10.97)個和(84.67±12.66)個，過表達KLF17后SW480細胞的體外侵襲能力顯著降低(P<0.05)。

與對照組相比，aP<0.01

圖2血管生成擬態(tài)相關基因mRNA表達變化

與對照組相比，aP<0.01

圖3KLF17轉染48h后SW480細胞中各基因蛋白表達變化

A．對照組；B. 實驗組；C. SW480細胞的體外侵襲能力變化統(tǒng)計圖

與對照組相比，aP<0.01

圖4顯微鏡下觀察3組SW480細胞體外侵襲能力

3 討 論

早期發(fā)現(xiàn)的結直腸癌患者在切除原發(fā)腫瘤治療后，約40%的患者在5年內會出現(xiàn)腹腔局部復發(fā)或者腫瘤轉移現(xiàn)象[8]。腫瘤細胞的轉移已經成為腫瘤難以治愈的重大問題之一。在腫瘤發(fā)生和細胞轉移過程中，腫瘤血管的形成具有重要調節(jié)作用。KLF17作為近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因廣泛引起人們的關注，但其對癌癥的抑制作用機制研究仍相對匱乏，且大多數(shù)研究集中在KLF17對腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移方面。KLF17對腫瘤細胞血管擬態(tài)形成的影響也應該引起我們的重視。

本研究通過檢測轉染過表達KLF17重組質粒的人結直腸癌SW480細胞中血管擬態(tài)形成相關基因的表達以及SW480體外侵襲能力，探究KLF17過表達對結直腸癌SW480細胞血管生成擬態(tài)以及侵襲能力的影響。過表達KLF17的SW480細胞中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的mRNA和蛋白表達水平在轉染24 h后顯著低于對照組，我們推測KLF17可以通過下調血管生成擬態(tài)相關基因的表達，抑制結直腸癌細胞血管生成擬態(tài)的形成。Maniotis等[9]在對葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究中發(fā)現(xiàn)，具有侵襲性的葡萄膜黑色素瘤細胞可以通過自身變形和基質重塑形成一種由細胞外基質界定的微循環(huán)血液流通管道，即血管生成擬態(tài)。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膠質細胞瘤以及胃腸道腫瘤等細胞中存在[10- 12]。腫瘤細胞血管生成擬態(tài)的形成能夠促進上皮細胞向內皮細胞轉化，VE- cadherin作為內皮細胞跨膜黏附蛋白可以通過促進內皮細胞排列形成管狀空腔誘導血管生成，促進血管發(fā)育成熟[13]；MMP- 2和LN- 5γ2是侵襲性黑色素瘤細胞形成血管樣通道所必須的[12]。VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的表達水平降低，說明結直腸癌細胞血管生成擬態(tài)形成受到抑制，阻礙腫瘤的發(fā)展以及細胞的轉移。

本研究通過Transwell實驗也證實，過表達KLF17的SW480細胞侵襲能力顯著低于對照組，表明KLF17可以抑制結直腸癌細胞的侵襲，這與KLF17阻礙結直腸癌細胞血管生成擬態(tài)形成是相符的。腫瘤血管生成擬態(tài)的形成導致血管上的腫瘤細胞易于脫落而直接進入血管內，從而促進腫瘤細胞發(fā)生廣泛血道轉移[13]。血管生成擬態(tài)在結腸癌中的研究報道屢見不鮮，血管生成擬態(tài)的發(fā)生與腫瘤的發(fā)展以及侵襲轉移相關，且發(fā)生血管生成擬態(tài)的患者中位生存期更短[14]。因此，阻礙腫瘤細胞血管生成擬態(tài)的生成途徑成為腫瘤治療的重要手段之一。本研究結果顯示，KLF17可以通過調控血管生成擬態(tài)形成相關基因及蛋白的表達，抑制腫瘤細胞血管生成擬態(tài)的形成，從而遏制腫瘤的發(fā)展以及侵襲轉移。

綜上所述，本研究結果表明，KLF17可以抑制SW480細胞的侵襲以及通過下調結直腸癌血管生成擬態(tài)相關基因的表達而阻遏其血管生成擬態(tài)的形成，為進一步研究KLF17在腫瘤治療中的作用奠定了基礎。