陳華濤，瞿紫微，孟慶彬，肖新波，趙春翔

(武漢市第一醫(yī)院 胃腸外科，湖北 武漢 430022)

結(jié)直腸癌已經(jīng)成為僅次于肺癌和乳腺癌的第3種對人類健康造成嚴(yán)重威脅的常見惡性腫瘤[1]。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年升高，且約20%的患者會發(fā)生癌癥的轉(zhuǎn)移[2]。血管生成擬態(tài)是近年來在部分惡性實體腫瘤中提出的一種新型供血循環(huán)系統(tǒng)，其存在對腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等具有重要調(diào)節(jié)作用[3]。結(jié)直腸癌中血管生成擬態(tài)已經(jīng)被證實，且發(fā)生血管生成擬態(tài)的腫瘤具有更強的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力[4]。血管上皮鈣黏附素(vascular endothelial cadherin, VE- cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶- 2(matrix metalloproteinase 2, MMP- 2)和粘連蛋白5γ2鏈(laminin5γ2,LN- 5γ2)的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)具有重要調(diào)節(jié)作用[5]。Krüppel樣因子(Krüppel like factors，KLFs)是一類在羧基端有3個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖以及凋亡的轉(zhuǎn)錄因子[6]。已有研究證實，KLF17通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化參與多種上皮性腫瘤的發(fā)生，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。本研究通過檢測轉(zhuǎn)染KLF17過表達(dá)質(zhì)粒后人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的基因和蛋白表達(dá)水平以及SW480細(xì)胞體外侵襲能力，探究KLF17對結(jié)直腸癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)以及體外侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SW480細(xì)胞由本實驗室提供，PIRES- EGFP質(zhì)粒購自武漢華聯(lián)科生物公司，KLF17重組表達(dá)質(zhì)粒PIRES- EGFP- KLF17由本實驗室自行構(gòu)建。胎牛血清和DMEM完全培養(yǎng)基購自南京建成生物工程研究所。Trizol購自北京艾德萊生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自TAKARA公司。KLF17抗體購自Santa Cruz公司，LN5γ2、VE- cadherin、MMP- 2抗體分別購自Chemicon公司、R&D公司、Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SW480細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于95%O2、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至貼壁后使用0.3%胰酶消化和傳代。

1.3 基因轉(zhuǎn)染實驗

采用電轉(zhuǎn)法將PIRES- EGFP- KLF17轉(zhuǎn)入SW480細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之前使用0.3%胰酶消化細(xì)胞，顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個·μl-1。將PIRES- EGFP- KLF17以及細(xì)胞懸液加入4 mm電轉(zhuǎn)杯中，混合均勻后冰浴10 min。電轉(zhuǎn)條件為450 V電壓、500 mu電容。電轉(zhuǎn)結(jié)束，再冰浴10 min，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)至每孔含1 ml DMEM培養(yǎng)液的24孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的SW480細(xì)胞作為對照。

1.4 Real- time qPCR檢測mRNA的表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后培養(yǎng)12、24、48和72 h的細(xì)胞，用Trizol裂解液裂解細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行單鏈cDNA的合成。采用Primer Premier 5.0進(jìn)行熒光定量PCR，引物由天一輝遠(yuǎn)生物公司設(shè)計合成，引物序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex TaqTM 9 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，cDNA溶液1 μl，DEPC H2O 9 μl；95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 20 s， 60 ℃ 15 s， 72 ℃ 20 s， 40 個循環(huán)。定量結(jié)果使用△△Ct法處理。

表1qPCR引物序列

基 因上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') KLF17TAGTAAAGGGGATGGT-GCGACTCACACCCTAGCCAAAGCCVE-cadherinCTGTCTACTCTTATCCCTT-GGTTTGTCAGTGTATCTACATCCT-GAMMP-2GGCATCCAGGTTATCGGGGACCATGTACGTTGCTATC-CAGGLN-5γ2GATCGAGAATCCTGACATT-GAGGAGCTGATATCTGAATCT-CACGAPDHCGACCACTTTGTCAAGCTCAAGGGGTCTACATG-GCAACTG

1.5 Western blotting 檢測蛋白表達(dá)水平

取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞進(jìn)行總蛋白的提取，使用BCA kit對蛋白進(jìn)行定量。每組取30 μg蛋白進(jìn)行SDS- PAGE電泳，將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后將封閉后的膜用一抗4 ℃孵育過夜。最后將膜用緩沖液沖洗2次，并用二抗在室溫條件下孵育2 h。

1.6 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力的檢測

將50 μl Matrigel和150 μl RPMI 1640培養(yǎng)基加入到Transwell小室濾膜中，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時使用胰酶消化，使用RPMI 1640培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個·ml-1。Transwell小室上室中接種10 μl細(xì)胞懸液，下室加入等量常規(guī)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛對細(xì)胞進(jìn)行固定后行Gimsa染色，最后在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)和拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KLF17表達(dá)水平變化

KLF17轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞24 h開始KLF17 mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.01，圖1A)，說明KLF17已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染入SW480細(xì)胞中且能夠正常表達(dá)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后KLF17蛋白表達(dá)水平與基因表達(dá)水平是相符的，顯著高于對照組(P<0.01,圖1B)，進(jìn)一步說明了KLF17成功轉(zhuǎn)入SW480細(xì)胞，并能夠正常表達(dá)。

與對照組相比，aP<0.01

圖1轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞KLF17表達(dá)量變化

2.2 血管生成擬態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)

與對照組相比，轉(zhuǎn)染KLF17后結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的mRNA表達(dá)水平在24 h開始顯著降低(P<0.01，圖2)。Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染KLF17 48 h后SW480細(xì)胞中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組，與48 h時mRAN表達(dá)水平一致(圖3)。

2.3 KLF17基因轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell結(jié)果表明48 h后實驗組和對照組均有細(xì)胞穿出微孔濾膜(圖4)。對照組和實驗組顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(135.33±10.97)個和(84.67±12.66)個，過表達(dá)KLF17后SW480細(xì)胞的體外侵襲能力顯著降低(P<0.05)。

與對照組相比，aP<0.01

圖2血管生成擬態(tài)相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化

與對照組相比，aP<0.01

圖3KLF17轉(zhuǎn)染48h后SW480細(xì)胞中各基因蛋白表達(dá)變化

A．對照組；B. 實驗組；C. SW480細(xì)胞的體外侵襲能力變化統(tǒng)計圖

與對照組相比，aP<0.01

圖4顯微鏡下觀察3組SW480細(xì)胞體外侵襲能力

3 討 論

早期發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌患者在切除原發(fā)腫瘤治療后，約40%的患者在5年內(nèi)會出現(xiàn)腹腔局部復(fù)發(fā)或者腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[8]。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為腫瘤難以治愈的重大問題之一。在腫瘤發(fā)生和細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤血管的形成具有重要調(diào)節(jié)作用。KLF17作為近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因廣泛引起人們的關(guān)注，但其對癌癥的抑制作用機制研究仍相對匱乏，且大多數(shù)研究集中在KLF17對腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移方面。KLF17對腫瘤細(xì)胞血管擬態(tài)形成的影響也應(yīng)該引起我們的重視。

本研究通過檢測轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF17重組質(zhì)粒的人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中血管擬態(tài)形成相關(guān)基因的表達(dá)以及SW480體外侵襲能力，探究KLF17過表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞血管生成擬態(tài)以及侵襲能力的影響。過表達(dá)KLF17的SW480細(xì)胞中VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的mRNA和蛋白表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染24 h后顯著低于對照組，我們推測KLF17可以通過下調(diào)血管生成擬態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成。Maniotis等[9]在對葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究中發(fā)現(xiàn)，具有侵襲性的葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞可以通過自身變形和基質(zhì)重塑形成一種由細(xì)胞外基質(zhì)界定的微循環(huán)血液流通管道，即血管生成擬態(tài)。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及胃腸道腫瘤等細(xì)胞中存在[10- 12]。腫瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，VE- cadherin作為內(nèi)皮細(xì)胞跨膜黏附蛋白可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞排列形成管狀空腔誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)血管發(fā)育成熟[13]；MMP- 2和LN- 5γ2是侵襲性黑色素瘤細(xì)胞形成血管樣通道所必須的[12]。VE- cadherin、MMP- 2和LN- 5γ2的表達(dá)水平降低，說明結(jié)直腸癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成受到抑制，阻礙腫瘤的發(fā)展以及細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

本研究通過Transwell實驗也證實，過表達(dá)KLF17的SW480細(xì)胞侵襲能力顯著低于對照組，表明KLF17可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲，這與KLF17阻礙結(jié)直腸癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成是相符的。腫瘤血管生成擬態(tài)的形成導(dǎo)致血管上的腫瘤細(xì)胞易于脫落而直接進(jìn)入血管內(nèi)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生廣泛血道轉(zhuǎn)移[13]。血管生成擬態(tài)在結(jié)腸癌中的研究報道屢見不鮮，血管生成擬態(tài)的發(fā)生與腫瘤的發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，且發(fā)生血管生成擬態(tài)的患者中位生存期更短[14]。因此，阻礙腫瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)的生成途徑成為腫瘤治療的重要手段之一。本研究結(jié)果顯示，KLF17可以通過調(diào)控血管生成擬態(tài)形成相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成，從而遏制腫瘤的發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，KLF17可以抑制SW480細(xì)胞的侵襲以及通過下調(diào)結(jié)直腸癌血管生成擬態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)而阻遏其血管生成擬態(tài)的形成，為進(jìn)一步研究KLF17在腫瘤治療中的作用奠定了基礎(chǔ)。