楊雪威，王思源，趙佳，徐錦江

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 健康管理中心，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 錦州 121000；3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，遼寧 錦州 121000)

橋本甲狀腺炎是一種自身免疫性疾病，橋本甲狀腺炎甲狀腺組織中有大量淋巴細胞浸潤，因此又叫慢性淋巴細胞性甲狀腺炎[1]。該病在30～50歲常見，在女性中多發(fā)，發(fā)病隱匿，容易造成誤診[2]。橋本甲狀腺炎的治療主要為糖皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、免疫療法等緩解橋本甲狀腺炎的癥狀，但上述治療副作用和局限性較大[3]。研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)生和維生素D缺乏有關(guān)[4- 5]，骨化三醇為維生素D的活性形式[6]。本研究建立實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型，并給予骨化三醇治療，觀察骨化三醇對實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠血清炎性細胞因子水平的影響，探討骨化三醇對橋本甲狀腺炎的治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性、清潔級、5～7周齡、120～140 g SD大鼠36只，購自北京生命科學(xué)研究所，許可證號：SYXK(京)2015- 0002。

1.1.2 主要試劑 抗甲狀腺球蛋白抗體(anti- thyroglobulin antibodies,TGAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor- ɑ，TNF- ɑ)、白細胞介素- 1(interleukin- 1，IL- 1)、白細胞介素- 6(interleukin- 6，IL- 6)ELISA試劑盒(美國Sigma公司)，完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、甲狀腺球蛋白(美國Sigma公司)，骨化三醇(青島正大海爾制藥有限公司)等。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠分組及模型制作 將36只大鼠隨機分為對照組、模型組和骨化三醇組，每組12只。對照組大鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理。模型組及骨化三醇組大鼠制備甲狀腺炎模型。實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型建立[7]：50 ml雙蒸水中加入甲狀腺球蛋白100 mg 徹底溶解，和完全弗氏佐劑等體積調(diào)勻，取0.5 ml 在大鼠頸部、腿部、腹腔、背部等多點皮下注射進行初次免疫，在同一時間及相同部位對對照組大鼠注射同等劑量的生理鹽水；第2周開始對大鼠進行加強免疫：將10 ml甲狀腺球蛋白和等量不完全弗氏佐劑混合后，對大鼠進行多點皮下注射，每周注射1次至第7周，并給予高碘水喂養(yǎng)，對照組大鼠正常飲水。7周后取大鼠眶靜脈血，采用ELISA法測定血清TPOAb水平，血清TPOAb水平>60 IU·ml-1為造模成功，24只大鼠均建模成功。

1.2.2 各組大鼠處理 造模成功后，骨化三醇組大鼠給予骨化三醇花生油溶液(0.045 μg·kg-1)灌胃，每天1次，共10周；對照組和模型組大鼠每天給予等量花生油灌胃，共10周。10周后麻醉成功后打開腹腔取動脈血進行甲狀腺抗體、甲狀腺功能、血清炎性細胞因子水平檢測，然后處死大鼠，取甲狀腺組織進行甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.3 大鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察 將大鼠甲狀腺組織在福爾馬林溶液中固定，并脫水透明、浸蠟、包埋，切成4 μm厚的切片，放入溫水中使切片展平，將石蠟切片置于載玻片中間，放入烤箱中烘烤20 min，伊紅染色5 min，光鏡下觀察各組大鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 血清甲狀腺抗體、甲狀腺功能、血清炎性細胞因子水平測定 將大鼠動脈血離心取血清，采用ELISA法測定血清TGAb、TPOAb、TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平；采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)、促甲狀腺激素(thyroid hormone，TSH)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化

光鏡下見：對照組大鼠甲狀腺濾泡呈橢圓形或圓形，甲狀腺上皮細胞排列均勻、整齊，未見漿細胞和淋巴細胞浸潤；模型組大鼠甲狀腺濾泡萎縮成扁平形或被大量破壞，大小不等、排列雜亂，內(nèi)有漿細胞浸潤，甲狀腺上皮細胞排列紊亂，見明顯淋巴細胞浸潤；骨化三醇組甲狀腺濾泡排列基本規(guī)則，偶有漿細胞浸潤，甲狀腺上皮細胞排列尚可，少量淋巴細胞浸潤。

2.2 3組大鼠甲狀腺抗體和甲狀腺功能比較

3組大鼠TGAb、TPOAb、FT3、FT4、TSH比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中模型組和骨化三醇組TGAb、TPOAb、FT3、FT4均高于對照組(P<0.05)，TSH均低于對照組(P<0.05)；骨化三醇組TGAb、TPOAb低于模型組(P<0.05)，骨化三醇組FT3、FT4、TSH和模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表13組大鼠甲狀腺抗體和甲狀腺功能比較

組 別nTGAb/IU·ml-1TPOAb/IU·ml-1FT3/pg·ml-1FT4/pg·ml-1TSH/μIU·ml-1對照組118.12±2.018.64±2.695.21±0.3617.28±5.243.69±1.64模型組10258.19±32.14a144.25±12.46a32.14±6.39a112.31±9.26a0.19±0.04a骨化三醇組1094.23±19.46ab69.27±10.28ab31.61±5.68a110.67±10.34a0.20±0.03aF值367.895557.718107.205439.13045.086P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 3組大鼠血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平比較

3組大鼠血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中模型組和骨化三醇組血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平均高于對照組(P<0.05)，骨化三醇組血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平低于模型組(P<0.05)，見表2。

3 討 論

實驗性自身免疫性甲狀腺炎的建模方法有多種，高碘誘導(dǎo)實驗性自身免疫性甲狀腺炎是利用高碘對抗體的刺激及對甲狀腺上皮細胞的破壞建立動物模型；免疫介導(dǎo)結(jié)合高碘誘發(fā)建立實驗性自身免疫性甲狀腺炎動物模型是將免疫介導(dǎo)和高碘誘發(fā)相結(jié)合建立實驗性自身免疫性甲狀腺炎動物模型，本實驗選用此法建立大鼠實驗性自身免疫性甲狀腺炎模型。其機理在于甲狀腺球蛋白誘導(dǎo)自身免疫，產(chǎn)生TGAb抗體，介導(dǎo)NK細胞毒性，破壞甲狀腺靶細胞；濾泡內(nèi)的甲狀腺球蛋白引起機體免疫調(diào)節(jié)紊亂，引起B(yǎng)淋巴細胞產(chǎn)生TPOAb和TGAb等抗體，引起甲狀腺自身免疫的發(fā)生[8- 9]。本法建立的實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型TPOAb和TGAb水平明顯升高，且甲狀腺組織中見濾泡受損，淋巴細胞彌漫性浸潤，表明模型均建立成功。

表23組大鼠血清TNF- ɑ、IL-1、IL-6水平比較

組 別nTNF-ɑ/pg·ml-1IL-1/pg·ml-1IL-6/pg·ml-1對照組1144.36±7.23114.25±35.1653.23±13.24模型組1068.72±13.24a278.16±64.13a121.26±15.41a骨化三醇組1053.43±10.26ab187.19±51.47ab87.19±16.01abF值14.47826.94354.805P值<0.001<0.001<0.001

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

維生素D在鈣磷代謝的動態(tài)平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，與甲狀腺功能有密切關(guān)系[10]。人體內(nèi)有多種細胞表達維生素D受體，維生素D通過和其受體結(jié)合發(fā)揮多種生理功能，維生素D可充當(dāng)免疫調(diào)節(jié)因子參與多種器官免疫性疾病的發(fā)生，橋本甲狀腺炎的發(fā)生和血清維生素D水平降低有關(guān)[11- 12]。骨化三醇可通過旁分泌和內(nèi)分泌的方式發(fā)揮作用，是維生素D的活性形式[13]，口服維生素D可降低橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺自身抗體水平，改善橋本甲狀腺炎的自身免疫反應(yīng)。本研究對實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠給予骨化三醇治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠甲狀腺濾泡和甲狀腺上皮細胞排列紊亂，有漿細胞和淋巴細胞浸潤，甲狀腺TGAb、TPOAb水平明顯升高；骨化三醇可有效改善實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠甲狀腺組織的形態(tài)學(xué)變化，降低甲狀腺TGAb、TPOAb水平。本研究也表明骨化三醇對橋本甲狀腺炎具有治療作用，骨化三醇可能通過旁分泌和內(nèi)分泌的方式降低實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺自身抗體滴度，從而發(fā)揮對實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠的治療作用。

在橋本甲狀腺炎的發(fā)病過程中，細胞免疫發(fā)揮關(guān)鍵作用，隨著橋本甲狀腺炎的進一步惡化，甲狀腺細胞和淋巴細胞釋放大量細胞因子，引起血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6等細胞因子水平升高，TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6等細胞因子和甲狀腺自身抗體之間相互影響，引起甲狀腺的病理改變[14- 15]。TNF- ɑ為促炎細胞因子的一種，主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，在惡性腫瘤、慢性炎性疾病、敗血癥、免疫性疾病等多種病理狀態(tài)下產(chǎn)生增多[16]。IL- 1又稱為淋巴細胞刺激因子，主要由活化的單核- 巨噬細胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)功能，可促進B細胞增殖、分泌抗體，協(xié)同刺激T細胞活化[17]。IL- 6是趨化因子家族成員，主要由成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、Th2細胞、單核巨噬細胞產(chǎn)生，具有促進血細胞發(fā)育，參與炎癥反應(yīng)，刺激T細胞增殖和活化，促進B細胞增殖、分泌抗體等生物學(xué)功能[18]。橋本甲狀腺炎為自身免疫性疾病，其血清TNF- ɑ、IL- 1水平升高，可引起IL- 6水平升高、B細胞抗體數(shù)量增多，大量的漿細胞可破壞甲狀腺濾泡上皮細胞，TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平的升高和甲狀腺濾泡的破壞過程直接引起橋本甲狀腺炎的發(fā)生[19- 22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平升高，骨化三醇可明顯降低實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平。骨化三醇對橋本甲狀腺炎的治療作用可能與骨化三醇可降低橋本甲狀腺炎血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平有關(guān)。