疏佳萍，柏文華，蔣犁

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 兒科，江蘇 南京 210009)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)具有高度增殖及多向分化潛能，可分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞等[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植可以改善缺氧缺血腦損傷的炎癥反應(yīng)[2]，但是干細(xì)胞的直接移植存在細(xì)胞變異分化瘤變可能及形成細(xì)胞栓等問(wèn)題。本研究旨在通過(guò)定向注射BMSCs上清液干預(yù)腦損傷模型，檢測(cè)炎癥因子分泌濃度，進(jìn)一步探討B(tài)MSCs旁分泌作用干預(yù)早產(chǎn)兒腦損傷的作用機(jī)制，為干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰酶(EDTA，美國(guó)Gibco公司)，MEM培養(yǎng)基、青霉素- 鏈霉素雙抗、PBS(美國(guó)Hyclone公司)，HE相關(guān)試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物科技有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重80～100 g,4～5周齡，用于分離培養(yǎng)BMSCs;新生3 d SD大鼠，用于制作早產(chǎn)兒腦損傷模型;所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由南京祥鴻生物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方法均符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs原代分離培養(yǎng)及純化 全骨髓貼壁法[3]培養(yǎng)BMSCs,水合氯醛麻醉大鼠，75%酒精浸泡消毒5 min后移至超凈臺(tái)，通風(fēng)櫥內(nèi)無(wú)菌條件下取雙側(cè)鼠股骨、脛骨浸入PBS中。1 ml注射器抽取PBS反復(fù)沖洗至髓腔發(fā)白，沖洗過(guò)程中可見(jiàn)紅色渾濁液體流出。收集混合液，室溫條件下1 500×g離心7 min,棄去上清液，用完全培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基+10%FBS+1%雙抗)重懸沉淀，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照4 000 cm-2接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后首次半量換液，每隔48～72 h全量換液，待細(xì)胞融合70%～80%，0.25%EDTA消化，等量完全培養(yǎng)基中和EDTA，1 500×g離心7 min收獲細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1∶2或1∶3接種于新培養(yǎng)瓶。倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。取P3代細(xì)胞待用，BMSCs鑒定參考本實(shí)驗(yàn)室所發(fā)表文章[4]。

1.2.2 動(dòng)物模型制備、實(shí)驗(yàn)分組及取材 模型制作：改良Longa線栓法栓塞左側(cè)頸總動(dòng)脈，腦缺血1 h后進(jìn)行混合氣(94%N2+6%O2)通氣2 h造缺氧模型，術(shù)后24 h參考Bederson JB評(píng)分行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分2～4分視為模型制作成功。分組：將新生3 d SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、PBS干預(yù)組(B組)和上清液干預(yù)組(C組)，每組8只。A組僅制作早產(chǎn)兒缺氧缺血腦損傷模型，無(wú)其他干預(yù)；B組制作早產(chǎn)兒缺氧缺血腦損傷模型，術(shù)后側(cè)腦室定向注射PBS；C組制作早產(chǎn)兒缺氧缺血腦損傷模型，術(shù)后側(cè)腦室定向注射培養(yǎng)BMSCs的上清液。實(shí)驗(yàn)取材：七氟烷吸入麻醉后取乳鼠全腦作病理切片材料，取部分乳鼠左側(cè)腦超聲波下所制腦勻漿作ELISA實(shí)驗(yàn)材料。

1.2.3 HE染色觀察各實(shí)驗(yàn)組大腦病理改變 (1)石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無(wú)水乙醇Ⅰ5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，自來(lái)水洗；(2)蘇木素染色：蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍(lán)，水洗；(3) 伊紅染色：切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水，入伊紅染液中染色5 min；(4)脫水封片：切片依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min、無(wú)水乙醇Ⅲ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、 二甲苯Ⅱ5 min透明，中性樹膠封片；(5)顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.4 檢測(cè)白細(xì)胞介素- 6(interleukin- 6, IL- 6)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- β(transforming growth factor- β,TGF- β)分泌濃度 (1)準(zhǔn)備所有的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；(2)復(fù)孔加入100 μl 2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加入100 μl 1× 檢測(cè)緩沖液，樣本孔加入50 μl 1×檢測(cè)緩沖液和50 μl預(yù)稀釋的樣本；(3)每孔加入50 μl稀釋的檢測(cè)抗體，室溫孵育1.5 h，洗滌6次；(4)每孔加入100 μl稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育30 min，洗滌6次；(5)每孔加入100 μl顯色底物，避光，室溫孵育5～30 min；(6)每孔加入100 μl終止液，30 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，參考波長(zhǎng)630 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)于重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行比較，并且采用bonferroni的兩兩比較進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)48 h內(nèi)由于培養(yǎng)基渾濁無(wú)法觀察細(xì)胞形態(tài)，96 h后細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)較小，有少量突起，呈小梭型，聚集生長(zhǎng)。7～8 d后細(xì)胞融合70%～80%。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，12 h后細(xì)胞可基本全部貼壁、伸展、均勻分布，細(xì)胞呈梭型、漩渦狀生長(zhǎng)。傳至第3代細(xì)胞融合80%～90%時(shí)，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞呈梭型、漩渦狀生長(zhǎng)(圖1)。收集第3代培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，1 500×g離心7 min，棄去脫落細(xì)胞及培養(yǎng)基中殘物等沉淀，取上清液供本研究使用。

圖1BMSCs形態(tài)×100

2.2 大腦組織病理切片

HE染色結(jié)果顯示A組側(cè)腦室擴(kuò)張，海馬區(qū)結(jié)構(gòu)變異明顯；C組側(cè)腦室擴(kuò)張程度較A組小，海馬結(jié)構(gòu)變異程度不明顯。見(jiàn)圖2。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)各組腦勻漿上清液IL- 6、TGF- β含量的比較

B組與A組相比， 1、3、5 d IL- 6含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組各時(shí)間點(diǎn)的IL- 6含量均低于A、B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明BMSCs上清液干預(yù)有效。同一組在不同時(shí)間點(diǎn)與該組第1天相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組3 d與5 d比較， IL- 6含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖2第5天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組側(cè)腦室鏡下染色形態(tài)HE×100

表1不同時(shí)間點(diǎn)各組IL-6含量比較pg·ml-1

與C組比較，aP<0.01；與同組1 d比較，bP<0.05；與同組3 d 比較，cP<0.05

B組與A組相比，各時(shí)間點(diǎn)的TGF- β表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組各時(shí)間點(diǎn)的TGF- β含量均低于A、B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同一組在不同時(shí)間點(diǎn)與該組第1天相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2不同時(shí)間點(diǎn)各組TGF-β含量比較pg·ml-1

與C組比較，aP<0.01；與同組1 d比較，bP<0.05

3 討 論

近年來(lái)，隨著早產(chǎn)兒發(fā)生率的逐漸上升[5]，以及早產(chǎn)兒存活率的顯著提高，早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)生率也隨之增加，其中腦白質(zhì)損傷(white matter injury, WMI)是最重要的腦損傷類型[6]，其病因和發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，常見(jiàn)于胎齡24～32周的早產(chǎn)兒[7]。WMI可導(dǎo)致腦癱，認(rèn)知、行為、視覺(jué)和聽(tīng)力障礙等[8- 9]。迄今國(guó)內(nèi)外對(duì)早產(chǎn)兒WMI的治療方法仍處于研究階段，其生存質(zhì)量的改善是國(guó)際性的重點(diǎn)攻克目標(biāo)。

BMSCs是存在于骨髓中的非造血成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下可向軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等方向進(jìn)行分化[10]。 因此 BMSCs 移植入體內(nèi)分化為功能細(xì)胞替代受損細(xì)胞被認(rèn)為是移植治療的主要機(jī)制。但是近年來(lái),隨著對(duì) BMSCs 生物學(xué)作用研究的深入,學(xué)術(shù)界認(rèn)為 BMSCs 參與組織損傷修復(fù)可能通過(guò)至少兩種方式：分化替代機(jī)制和旁分泌機(jī)制,并且 BMSCs 的旁分泌機(jī)制可能在組織修復(fù)中發(fā)揮著比分化替代更為關(guān)鍵的作用[11]。BMSCs旁分泌的生物活性因子主要有生長(zhǎng)因子及其受體如VEGF,細(xì)胞因子和趨化因子等[12]。

機(jī)體多種細(xì)胞均可分泌非活性狀態(tài)的TGF- β，一般在細(xì)胞分化活躍的組織常含有較高水平的TGF- β。TGF- β的生物學(xué)功能研究主要在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面[13]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TGF- β對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs上清液移植后第5天，TGF- β表達(dá)較PBS干預(yù)組明顯上升，說(shuō)明BMSCs上清液的神經(jīng)保護(hù)作用可能與改變TGF- β的表達(dá)量有關(guān)?？赡苡捎趥€(gè)體差異導(dǎo)致TGF- β含量不同，也可能由于TGF- β隨炎癥刺激而激發(fā)神經(jīng)免疫反應(yīng)的增高，造成各時(shí)間點(diǎn)TGF- β含量不同。說(shuō)明BMSCs上清液干預(yù)腦損傷模型后可以促進(jìn)保護(hù)性因子TGF- β的分泌。

目前，已有研究明確顯示TGF- β在成人腦組織中具有神經(jīng)保護(hù)功能[14]，但其在早產(chǎn)兒腦損傷中的研究尚未闡明。合理掌握和應(yīng)用TGF- β保護(hù)和損傷作用的分界點(diǎn)，既要發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)抑制其損傷效應(yīng)，這是未來(lái)早產(chǎn)兒腦損傷新靶點(diǎn)治療的研究方向。

IL- 6調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)及造血功能，并在機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。神經(jīng)炎癥是腦損傷的重要病理表現(xiàn)，形成的過(guò)度炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)破壞血腦屏障，損傷腦神經(jīng)細(xì)胞并影響損傷部位生理功能[15]。本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs移植后第3天上清液干預(yù)組IL- 6較PBS干預(yù)組明顯下降，說(shuō)明上清液的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制IL- 6的釋放有關(guān)。可能由于個(gè)體差異造成IL- 6含量不同，也可能由于炎癥因子激發(fā)體內(nèi)保護(hù)機(jī)制，造成各時(shí)間點(diǎn)IL- 6含量不同。初步預(yù)示BMSCs上清液干預(yù)腦損傷模型后可以抑制促炎因子IL- 6的分泌。

綜上所述，側(cè)腦室立體定向移植BMSCs上清液可改善腦損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可能與移植BMSCs上清液后腦組織中IL- 6和TGF- β表達(dá)水平的變化有關(guān)。但移植后BMSCs上清液抑制IL- 6表達(dá)、促進(jìn)TGF- β表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，可能與BMSCs通過(guò)旁分泌作用使上清液內(nèi)含有營(yíng)養(yǎng)性因子或傳遞相關(guān)炎癥信號(hào)的物質(zhì)有關(guān)，我們后續(xù)將進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。