魯明騫，馮雪松，盧宏達，雷章，許新華，盧馳，李薇，孔慶志

(1. 三峽大學第一臨床醫(yī)學院腫瘤研究所&湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，湖北 宜昌 443003；2. 武漢市中心醫(yī)院&武漢市腫瘤研究所，湖北 武漢 430061)

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，每年有160多萬人被診斷為乳腺癌，而死于乳腺癌的患者超過120萬人，其發(fā)病和死亡人數(shù)分別占全世界乳腺癌的12.2%和9.6%[1]。據(jù)國家衛(wèi)計委疾病防治控制局《2015年中國腫瘤登記年報》[2]報道：乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤發(fā)病的第1位，其次為肺癌、結直腸癌、胃癌和宮頸癌；乳腺癌死亡率占城市女性惡性腫瘤死亡的第5位。乳腺癌的治療以手術、放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向藥物等治療為主。近年來隨著現(xiàn)代分子生物學和基因組學等技術飛速發(fā)展，研究者逐步加深了對乳腺癌分子機制的理解，特別是乳腺癌雌激素受體(ER)/孕激素受體(PR)的內(nèi)分泌治療和人類表皮生長因子受體2(HER2)的靶向治療取得了較喜人的成果，但仍有約5%的患者初診時即為晚期，經(jīng)過術后規(guī)范化治療后30%患者仍可出現(xiàn)復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[3]。因此，人們越來越渴望在其他輔助治療中尋找新的治療方法。傳統(tǒng)中藥因不良反應小、抗癌方式獨特而越來越被廣泛地應用于臨床，但是許多中藥的抗癌機制目前尚缺乏較深入的研究?；倍巧L在槐樹干上的槐栓菌，早在1 500多年前就已被應用于惡性腫瘤的治療，近年來人們發(fā)現(xiàn)槐耳對多種惡性腫瘤效果明顯[4- 8]，但多是消化道惡性腫瘤，而在乳腺癌的治療中研究較少。因此，本研究以乳腺癌細胞系MCF- 7及MDA- MB- 231為實驗對象，采用MTT法檢測槐耳清膏對乳腺癌細胞的抑制作用，以闡明槐耳清膏抑制乳腺癌的作用機制，為其臨床應用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

槐耳清膏由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供，精確稱取槐耳清膏，將其溶于PBS中，使其終濃度為100 mg·ml-1，后以0.22 μm的微孔濾過膜過濾除菌，放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 分組

實驗組取100 mg·ml-1的槐耳清膏儲液，分別用RPMI1640培養(yǎng)液和DMEM完全培養(yǎng)基配制成濃度為3、6、9 mg·ml-1的槐耳清膏，取RPMI1640培養(yǎng)液2 ml 作為空白對照組，分別作用于人乳腺癌MCF- 7及MDA- MB- 231細胞。

1.3 細胞株

人乳腺癌細胞(MCF- 7及MDA- MB- 231)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(Amercian Type Culture Collection，ATCC)，用含10%胎牛血清、1%雙抗高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，使細胞處于對數(shù)生長期待用。

1.4 MTT法檢測細胞抑制率

將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，用0.25%胰酶消化，1 200 r·min-1離心10 min，調(diào)整細胞濃度約2×103個·ml-1，分別鋪96孔培養(yǎng)板，每孔加入細胞懸液100 μl，每組細胞設置36孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去除舊的培養(yǎng)基，用PBS洗孔2次，對照組加入培養(yǎng)基100 μl，實驗組加入濃度分別為3、6、9 mg·ml-1的槐耳清膏，每孔終體積為100 μl，培養(yǎng)48 h后取出96孔板，吸去舊的培養(yǎng)液，PBS洗孔2次，每孔加入MTT溶液10 μl，振蕩后放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使晶體完全溶解，在490 nm的波長處分別測定每孔吸光度值(OD值)并記錄。根據(jù)抑制率公式：細胞抑制率(inhibitor rate，IR)(%)=(空白對照組吸光度值-實驗組吸光度值)/空白對照組吸光度值×100%，計算每組的細胞抑制率。每組平行各設6個復孔，計算出細胞抑制率平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩獨立樣本采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 槐耳清膏對乳腺癌MCF- 7細胞的增殖抑制作用

實驗結果顯示，槐耳清膏作用于乳腺癌MCF- 7細胞48 h后，對MCF- 7細胞有明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加其抑制作用逐漸增強，細胞活性和增殖能力下降，呈一定的量效關系。在空白對照組中，槐耳清膏對MCF- 7細胞無明顯細胞毒作用。與空白對照組比較，各濃度組的OD值逐漸下降，在槐耳清膏濃度為3、6、9 mg·ml-1時其細胞抑制率分別為(17.4±1.4)%、(58.6±3.7)%、(76.1±2.9)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

組 別nOD值抑制率/%空白對照組60.973±0.0233.1±1.23 mg·ml-1槐耳清膏組60.804±0.02517.4±1.4a6 mg·ml-1槐耳清膏組60.403±0.03458.6±3.7a9 mg·ml-1槐耳清膏組60.233±0.01776.1±2.9a

與空白對照組比較，aP<0.05

與空白對照組比較，aP<0.05

圖1槐耳清膏對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

Fig1EffectofHuaierontheproliferationofbreastcancercelllineMCF-7

2.2 槐耳清膏對乳腺癌MDA- MB- 231細胞的增殖抑制作用

實驗結果顯示，槐耳清膏作用于乳腺癌MDA- MB- 231細胞48 h后，對MDA- MB- 231細胞抑制作用較弱，且隨著藥物濃度的增加其抑制作用變化不明顯，細胞活性和增殖能力仍較高。與空白對照組比較，各濃度組的OD值變化不大，在槐耳清膏濃度為3、6、9 mg·ml-1時其細胞抑制率分別為(10.3±1.7)%、(15.1±2.6)%、(17.8±3.9)%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、圖2。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，歐美等發(fā)達國家其發(fā)病率全球范圍內(nèi)最高。隨著我國人民生活水平的不斷提高，環(huán)境和飲食結構的不斷變化，數(shù)十年來我國乳腺癌的發(fā)病率呈快速增長，而且呈年輕化趨勢，現(xiàn)已居女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌的治療以手術、放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向藥物治療、中醫(yī)中藥等綜合治療為主，使乳腺癌的生存率不斷提高，死亡率不斷下降，患者生活質(zhì)量大大改善，在美國、英國等發(fā)達國家，乳腺癌的死亡率已較20世紀80年代末下降了20%～30%，其成績的取得主要得益于乳腺癌綜合治療的進展。

組 別nOD值抑制率/%空白對照組60.982±0.0232.8±1.63 mg·ml-1槐耳清膏組60.881±0.03310.3±1.7a6 mg·ml-1槐耳清膏組60.835±0.04215.1±2.6a9 mg·ml-1槐耳清膏組60.807±0.02617.8±3.9a

與空白對照組比較，aP>0.05

與空白對照組相比，aP>0.05

圖2槐耳清膏對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響

Fig2EffectofHuaieronproliferationofbreastcancercelllineMDA-MB-231

手術是乳腺癌的主要治療方式，但單純手術并不能解決乳腺癌術后復發(fā)或轉(zhuǎn)移等問題。隨著人們對乳腺癌的認識的提升，考慮乳腺癌是一種全身性疾病，化療、放療才逐步被重視，但放、化療易出現(xiàn)不良反應。Schinzinger提出卵巢切除可以治療乳腺癌，開創(chuàng)了乳腺癌內(nèi)分泌治療的先河[9]。1977年他莫昔芬的應用使內(nèi)分泌治療真正走向了內(nèi)科治療，后出現(xiàn)芳香化酶抑制劑(aromatase inhibitor，AI)。近年一種全新的內(nèi)分泌藥物氟維司群的問世，克服了既往內(nèi)分泌藥物引起的子宮內(nèi)膜增厚甚至子宮內(nèi)膜癌和骨質(zhì)疏松的風險，能使激素受體上的轉(zhuǎn)錄活性AF1和AF2區(qū)域失活，加速雌激素的降解[10]。但內(nèi)分泌治療只適合于激素受體[ER和(或)PR]陽性患者，而且有效率有限，容易產(chǎn)生耐藥并有一定不良反應。幾十年來針對HER2的靶向藥物(赫賽汀)改善了部分患者的生存和生活質(zhì)量，但易出現(xiàn)耐藥[11- 12]。目前研究表明磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/mTOR(PI3K- AKT- mTOR)通路與內(nèi)分泌治療耐藥和靶向治療耐藥密切相關[13- 14]。針對耐藥機制的研究發(fā)現(xiàn)信號通路的交互作用是內(nèi)分泌藥物和靶向藥物治療失敗的主要機制之一[15]。mTOR抑制劑依維莫司能有效阻滯腫瘤細胞信號的傳導，抑制腫瘤細胞生長[14]，但未完全應用于臨床，而且價格較昂貴。而中醫(yī)藥治療是乳腺癌治療的重要手段，能增強人體抵抗力，降低放化療患者的不良反應，提高患者生活質(zhì)量，延長患者生存時間，彌補了現(xiàn)代醫(yī)學在腫瘤治療上的不足[16]。

槐耳是我國重要的藥用真菌類抗腫瘤藥物之一，早在1 500多年前就已作為中草藥應用于各種疾病的治療，其功效主要有止血、止痢、抗癌、主痔瘡出血、便血、崩漏、痢疾、肝癌、肝炎等[17]。槐耳多分布于河北、山東、陜西等地，因其野生資源較缺乏，近年來江蘇等地以固體發(fā)酵法培養(yǎng)槐栓菌以供臨床應用(槐耳清膏)，其水解產(chǎn)物含6種單糖以及18種氨基酸，藥理作用主要有抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡、減少細胞的遷移和侵襲、提高免疫功能及逆轉(zhuǎn)細胞耐藥等[18- 20]，抗癌成分主要為槐耳蛋白多糖(PS- T)。

本實驗以乳腺癌MCF- 7及MDA- MB- 231細胞為研究對象，采用MTT法檢測不同濃度槐耳清膏對細胞的抑制率，探討了槐耳清膏對其兩種細胞的增殖抑制作用。結果顯示，在槐耳清膏濃度為3、6、9 mg·ml-1作用MCF- 7細胞48 h后細胞增殖抑制率分別為(17.4± 1.4)%、(58.6±3.7)%、(76.1±2.9)%，實驗組各濃度的槐耳清膏對乳腺癌MCF- 7細胞的增殖抑制率與空白對照組比較明顯增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，在同一時間，隨著藥物濃度的增加，其抑制作用呈逐漸增強的趨勢，而腫瘤細胞活性和增殖能力逐步下降，其抑制越明顯(P<0.05)，表明槐耳清膏對MCF- 7的抑制作用與藥物劑量有明顯的關系，而且具有一定的量效關系。崔洋等[21]研究顯示，槐耳清膏對骨肉瘤MG63細胞作用24 h和48 h后細胞活力明顯升高，在體外可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，減弱細胞的遷移和侵襲能力。本研究對MDA- MB- 231細胞的實驗結果顯示，在槐耳清膏濃度為3、6、9 mg·ml-1時其細胞抑制率分別為(10.3±1.7)%、(15.1±2.6)%、(17.8±3.9)%，OD值分別為(0.881±0.033)、(0.835±0.042)、(0.807±0.026)，結果表明槐耳清膏對MDA- MB- 231細胞抑制作用較弱，且隨著藥物濃度的增加，其抑制作用無明顯變化，細胞活性和增殖能力仍較高，各濃度組的OD值變化不大，與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

綜上所述，槐耳清膏對乳腺癌MCF- 7細胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，這種抑制作用增強，具有一定的藥物濃度和時間的量效關系。但槐耳清膏對乳腺癌MDA- MB- 231細胞無明顯的增殖抑制作用?；倍甯鄬CF- 7細胞增殖抑制與細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性等因素有關，表明槐耳清膏對MCF- 7細胞的增殖抑制和抗腫瘤機制有賴于其它諸多基因的相互調(diào)節(jié)，經(jīng)多步驟、多階段而實現(xiàn)的。對MDA- MB- 231細胞作用后未出現(xiàn)明顯抑制作用，說明槐耳清膏未能影響MDA- MB- 231細胞的某個啟動基因，無法引起一系列基因的改變而達到抑制腫瘤細胞的作用，也可能與這種細胞具有高度侵襲性和高轉(zhuǎn)移性有關，槐耳清膏作用有限或藥物濃度不夠。隨著研究的不斷深入，中藥誘導腫瘤細胞增殖與凋亡將為腫瘤治療提供新的思路、新靶點。