胡秀秀，潘玉琴，王書奎

[1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)中心實驗室，江蘇 南京 210012]

結(jié)直腸癌是發(fā)生于結(jié)腸或直腸中的常見消化道腫瘤之一。近年來受到人口老齡化和環(huán)境污染等影響，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率居高不下[1]，已經(jīng)成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點。microRNAs(miRNAs)是一種進化上保守的內(nèi)源性非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)，在生長發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[2]。miRNA- 485- 5p在多種腫瘤如口腔鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、肺腺癌、胃癌、乳腺癌等中被報道為抑癌基因。但miR- 485- 5p在結(jié)直腸癌中的功能尚未見報道。因此，本研究旨在探討miR- 485- 5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲等表型的影響及其可能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

miR- 485- 5p潛在靶基因CD147的3′端非編碼區(qū)(3- untranslated region，3′UTR)野生型(WT，包括預(yù)測的miR- 485- 5p靶位點)和突變型(Mut，miR- 485- 5p結(jié)合位點的8個核苷酸被替換)質(zhì)粒由蘇州泓迅生物科技股份有限公司構(gòu)建，其序列經(jīng)DNA測序證實無誤。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

293細(xì)胞、正常腸黏膜細(xì)胞(FHC)和2種人的結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT8和HCT116)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。4種細(xì)胞在含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone，美國)的高糖型DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)中常規(guī)培養(yǎng)。miR- 485- 5p模擬物(miR- 485- 5p mimic)及其相應(yīng)的陰性對照(miR- NC)由廣州銳博公司合成。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%時使用Lipofectamine 3000(Invitrogen，美國)進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟參照說明書。

1.3 總RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT- PCR)

采用TRIzol法(Invitrogen，美國)提取總RNA，采用上海吉瑪公司的染料法Hairpin- it miRNAs qRT- PCR定量試劑盒檢測miR- 485- 5p，引物亦由上海吉瑪公司合成,U6作為內(nèi)源性對照。用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa，中國)進行RNA逆轉(zhuǎn)錄后，SYBR4?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa，中國)檢測CD147 mRNA的表達(dá)，β- 肌動蛋白(β- actin)作為內(nèi)參。待測基因引物設(shè)計：CD147上游引物為5′- CCATGCTGGTCTGCAAGTCAG- 3′，下游引物為5′- CCGTTCATGAGGGCCTTGTC- 3′；β- actin上游引物為5′- CTGGAACGGTGAAGGTGACA- 3′，下游引物為5′- AAGGGACTTCCTGTAACAACGCA- 3′。所有反應(yīng)均在Applied Biosystems 7500型定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)上進行。通過2-ΔΔCt方法分析CD147和miR- 485- 5p的相對表達(dá)水平。

1.4 CCK- 8法檢測細(xì)胞增殖能力

使用CCK- 8溶液(凱基，中國)檢測轉(zhuǎn)染miR- 485- 5p mimic或miR- NC 24、48、72和96 h的HCT8和HCT116細(xì)胞的存活率。每個時間點設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力

在Transwell小室中測定已轉(zhuǎn)染miR- 485- 5p mimic或miR- NC的結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力。實驗步驟如文獻[3]描述。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達(dá)

實驗步驟如文獻[4]描述，抗體如下：CD147(目錄號Ab108317，Abcam，1∶5 000)、GAPDH(目錄號ab181602，Abcam，1∶10 000)及山羊抗兔IgG- HRP(目錄號Ab6721，Abcam，1∶10 000)。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測靶基因

使用Lipofectamine 3000將miR- 485- 5p mimic或miR- NC與合成的雙熒光素酶報告基因CD147- 3′UTR- WT或CD147- 3′UTR- Mut共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，隨后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天，中國)在發(fā)光檢測儀(GloMax- 20/20 Luminometer，Promega，美國)中檢測轉(zhuǎn)染48 h后的熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

使用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR- 485- 5p在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果顯示,miR- 485- 5p在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT8和HCT116中的表達(dá)水平較FHC細(xì)胞顯著降低(P<0.05，圖1)。

與FHC細(xì)胞比較，aP<0.05

圖1各組細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)情況

Fig1ExpressionofmiR-485-5pinvariousgroupsofcells

2.2 miR- 485- 5p mimic在HCT116和HCT8細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

為了研究miR- 485- 5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，HCT116和HCT8細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR- 485- 5p mimic或miR- NC，采用qRT- PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。實驗結(jié)果表明,HCT116和HCT8轉(zhuǎn)染miR- 485- 5p mimic后，miR- 485- 5p的表達(dá)分別增高332倍和309倍(圖2)。因此可以看出，miR- 485- 5p mimic及陰性對照轉(zhuǎn)染良好，轉(zhuǎn)染方案能夠有效地提高結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR- 485- 5p的表達(dá)，有利于后續(xù)的細(xì)胞功能學(xué)和靶基因的實驗研究。

U6為內(nèi)對照，aP<0.001

圖2qRT-PCR檢測miR-485-5pmimic及miR-NC在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

Fig2DetectionofmiR-485-5pmimicandmiR-NCtransfectionefficiencyinhumancolorectalcancercellsbyqRT-PCR

2.3 miR- 485- 5p過表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

與miR- NC組相比，過表達(dá)miR- 485- 5p在48 h后能夠顯著抑制HCT116細(xì)胞的增殖能力，在72 h后能夠顯著抑制HCT8細(xì)胞的增殖能力(圖3)。提示miR- 485- 5p過表達(dá)能夠抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。

與miR- NC組比較，aP<0.05

圖3CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力

Fig3CCK-8assayforproliferationoftransfectedhumancolorectalcancercells

2.4 miR- 485- 5p過表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，miR- 485- 5p過表達(dá)組細(xì)胞的侵襲數(shù)目顯著低于miR- NC組(圖4)，提示miR- 485- 5p過表達(dá)能夠抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外侵襲能力。

與miR- NC組比較，aP<0.01

圖4Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力(×200)

Fig4Transwellassayfortheinvasionoftransfectedhumancolorectalcancercells(×200)

2.5 miR- 485- 5p靶基因預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C

miRNA靶基因預(yù)測軟件microRNA.org (http://www.microrna.org/)和miRDB(http://mirdb.org/)提示CD147可能為miR- 485- 5p調(diào)控的靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，CD147- 3′UTR- WT和miR- 485- 5p mimic共轉(zhuǎn)染后熒光素酶水平明顯下降，CD147- 3′UTR- Mut和miR- 485- 5p mimic共轉(zhuǎn)染后則沒有明顯的下降(P>0.05，圖5)，提示miR- 485- 5p對CD147可能有直接的調(diào)控作用。

與miR- NC+WT組比較，aP<0.01

圖5雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶基因

Fig5Dualluciferasereporterassaysverifytargetgenes

2.6 miR- 485- 5p過表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞中CD147表達(dá)的影響

qRT- PCR及Western blotting結(jié)果顯示，miR- 485- 5p過表達(dá)組細(xì)胞中CD147 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于miR- NC組(圖6)。結(jié)果提示miR- 485- 5p過表達(dá)能夠抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞中CD147的表達(dá)。

與miR- NC組比較，aP<0.01

圖6qRT-PCR及Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染后人結(jié)直腸癌細(xì)胞CD147表達(dá)

Fig6DetectionofCD147expressioninhumancolorectalcancercellsaftertransfectionbyqRT-PCRandWesternblotting

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明，miRNA作為抑癌基因或者促癌基因，在結(jié)直腸癌的基因調(diào)控機制中扮演著重要角色。因此，研究結(jié)直腸癌相關(guān)miRNA將加深對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展分子機制的認(rèn)識，為這種致命癌癥的有效治療提供新的視角。

研究表明，miR- 485- 5p在多種腫瘤中低表達(dá)并可抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Guo等[5]報道m(xù)iR- 485- 5p發(fā)揮了抑癌作用，其可能調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，同時也證實斯鈣素2(stanniocalcin 2，STC2)是miR- 485- 5p的直接靶點。與這些報道一致，我們發(fā)現(xiàn)2種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR- 485- 5p的表達(dá)水平比正常腸黏膜細(xì)胞低，提示miR- 485- 5p的低表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的進展有關(guān);在功能實驗上，上調(diào)miR- 485- 5p的表達(dá)可以明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲。miRNA靶基因預(yù)測軟件提示CD147可能是miR- 485- 5p的潛在下游靶標(biāo)。CD147是廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面的一種單鏈跨膜糖蛋白，在人體內(nèi)多種組織細(xì)胞如粒細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、分化的巨噬細(xì)胞等都檢測到CD147的表達(dá)[6- 8]。其可以與不同的蛋白偶聯(lián)，參與調(diào)節(jié)機體多種生理過程。研究發(fā)現(xiàn)CD147不僅在體內(nèi)正常的組織細(xì)胞中有表達(dá)，其在多種腫瘤細(xì)胞中也被檢測到且通常表達(dá)量增高，主要包括結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤等[9- 13]。研究表明，CD147與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成、化學(xué)耐藥等方面都相關(guān)[14- 15]。CD147可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)或基底膜的多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[16]；CD147可以與單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白(monocarboxylate transporters，MCTs)結(jié)合，促進MCTs對細(xì)胞內(nèi)無氧糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸的轉(zhuǎn)運，流向腫瘤細(xì)胞的乳酸使腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境酸化，進而促進腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移等[17]；CD147還能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，參與腫瘤血管的形成過程[18]。因此，CD147在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中，雙熒光素酶報告基因檢測證實miR- 485- 5p可與CD147的3′UTR部分結(jié)合。在通過轉(zhuǎn)染miR- 485- 5p mimic，上調(diào)其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)后，qRT- PCR和Western boltting均檢測到CD147下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明CD147和miR- 485- 5p之間呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，我們認(rèn)為miR- 485- 5p可能直接靶向調(diào)節(jié)CD147，抑制結(jié)直腸癌的生長和侵襲。但是CD147不是唯一可以被miR- 485- 5p靶向調(diào)節(jié)的。眾所周知，單個miRNA可能調(diào)控大量的mRNA，而單個mRNA也可以被多個miRNA調(diào)控。miR- 485- 5p及其靶基因CD147只是復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個因素。探索miR- 485- 5p調(diào)控的其他基因或調(diào)節(jié)CD147的其他miRNA是必不可少的，這將能夠更深入地了解結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機制。

本研究揭示了miR- 485- 5p的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌生理病理過程之間的潛在關(guān)系。miR- 485- 5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，外源miR- 485- 5p通過調(diào)節(jié)CD147抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。這些發(fā)現(xiàn)為我們提供了一個新的視角，可能有助于開發(fā)一些新的有價值的結(jié)直腸癌預(yù)防和治療方法。另一方面，導(dǎo)致miR- 485- 5p表達(dá)下調(diào)的機制以及miR- 485- 5p抑制結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制仍需進一步研究。