秦小菀，惠曉霞，高偉霞，郭潔，金志鵬

(1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院 兒科急診，河南 南陽(yáng) 473000；2.鄭州兒童醫(yī)院 兒科，河南 鄭州 450053)

毛細(xì)支氣管炎多發(fā)生在2歲以?xún)?nèi)小兒，是嬰幼兒常見(jiàn)的呼吸道疾病之一，多由呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染引起，咳嗽、喘憋和“三凹征”為其主要臨床表現(xiàn)，是肺炎的一種特殊類(lèi)型，臨床治療上尚無(wú)特效藥物[1- 2]。柴葛口服液(葛根、柴胡、板藍(lán)根、金銀花、菊花、連翹、甘草、竹葉等組成)中的中藥成分對(duì)細(xì)菌、病毒感染引起的腮腺炎、上呼吸道感染等療效確切[3]。柴葛口服液對(duì)毛細(xì)支氣管炎免疫功能的作用尚不清楚。本研究采用RSV感染建立毛細(xì)支氣管炎小鼠模型，并給予柴葛口服液治療，以利巴韋林為陽(yáng)性對(duì)照，觀察柴葛口服液對(duì)毛細(xì)支氣管炎小鼠的治療作用及對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性、清潔級(jí)BALB/c小鼠60只，體重19～23 g，購(gòu)自北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，許可證號(hào)：SYXK(京)2015- 0006，飼養(yǎng)于河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。病毒和細(xì)胞：RSV病毒A亞型(首都兒科研究所)，Hep- 2細(xì)胞株(西京醫(yī)院兒科實(shí)驗(yàn)室)。主要藥物：柴葛口服液(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨床藥學(xué)室研制，批號(hào)20170122，含葛根素10 mg·ml-1、柴胡皂苷3 mg·ml-1)，利巴韋林注射液(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司，批號(hào)20150326，規(guī)格5 ml∶0.5 g)。主要試劑和儀器：RPMI 1640培養(yǎng)液、多聚甲醛、胰蛋白酶、小牛血清(美國(guó)Sigma公司)，ELISA試劑盒、流式細(xì)胞儀(美國(guó)R&D公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠分組及毛細(xì)支氣管炎模型制備 將60只小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組，每組12只。除對(duì)照組外，其它各組均建立毛細(xì)支氣管炎小鼠模型。建模方法：小鼠麻醉成功后順小鼠鼻腔滴入RSV病毒液100 μl，滴鼻后保持小鼠頭部后仰1 min使RSV病毒液流入小鼠支氣管、氣管部位，1次·d-1,共2 d；對(duì)照組同法用等量生理鹽水滴鼻，1次·d-1,共2 d。

1.2.2 各組小鼠處理 感染病毒后，柴葛低劑量組和柴葛高劑量組分別給予柴葛口服液低劑量(根據(jù)柴葛中葛根素含量按臨床用量計(jì))(5.18 mg·kg-1·d-1)和高劑量(23.1 mg·kg-1·d-1)灌胃治療，1次·d-1；利巴韋林組給予利巴韋林10 mg·kg-1·d-1灌胃治療，1次·d-1；對(duì)照組和模型組給予0.5 ml生理鹽水灌胃，1次·d-1；共7 d。7 d后采集各組小鼠外周血，然后處死小鼠用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 肺組織病毒滴度測(cè)定 取小鼠肺組織勻漿，勻漿液2 500 r·min-1離心15 min，收集上清液，用病毒維持液稀釋肺組織上清液成不同梯度，將Hep- 2細(xì)胞接種到96孔板中，每孔細(xì)胞接種10-1～10-8濃度上清液，并設(shè)立陰性對(duì)照，每天顯微鏡下觀察細(xì)胞情況，計(jì)算第7天時(shí)病毒滴度。

1.2.4 肺指數(shù)測(cè)定 處死前稱(chēng)取小鼠體重，取各組小鼠肺組織稱(chēng)肺組織重量，小鼠肺指數(shù)=小鼠肺組織重量/小鼠體重。

1.2.5 肺組織病理學(xué)評(píng)分測(cè)定 取各組小鼠肺組織，采用常規(guī)HE染色，光鏡下觀察小鼠肺組織HE染色情況并拍照，計(jì)算小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分(1～2分不可能，3～4分可能，5～6分很可能，7分極可能，8～9分明確)：分別從肺實(shí)質(zhì)肺炎程度、血管周?chē)?rùn)范圍、細(xì)支氣管腔滲出程度、細(xì)支氣管及支氣管周?chē)?rùn)程度及范圍對(duì)小鼠肺組織劃分等級(jí)和累計(jì)評(píng)分，總分0～26分，評(píng)分越高，小時(shí)肺部炎性損傷程度越重。

1.2.6 外周血輔助性T細(xì)胞17(helper T cells 17，Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)測(cè)定 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠外周血Th17和Treg細(xì)胞表達(dá)水平。

1.2.7 血清白細(xì)胞介素- 4(Interleukin- 4，IL- 4)、白細(xì)胞介素- 10(Interleukin- 10，IL- 10)、白細(xì)胞介素- 17(Interleukin- 4- 17，IL- 17)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- β(transforming growth factor- beta，TGF- β)水平測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme- linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定各組小鼠血清IL- 4、IL- 10、IL- 17、TGF- β水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組肺組織病毒滴度和肺指數(shù)比較

模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組肺指數(shù)均高于對(duì)照組(P<0.05)，柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組病毒滴度和肺指數(shù)均低于模型組(P<0.05)，柴葛高劑量組病毒滴度和肺指數(shù)低于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05)，柴葛低劑量組和利巴韋林組病毒滴度和肺指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組肺組織病理學(xué)評(píng)分比較

模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組肺病理學(xué)評(píng)分均高于對(duì)照組(P<0.05)，柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組肺病理學(xué)評(píng)分均低于模型組(P<0.05)，柴葛高劑量組肺病理學(xué)評(píng)分低于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05)，柴葛低劑量組和利巴韋林組肺病理學(xué)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1各組肺組織病毒滴度和肺指數(shù)比較

組 別n病毒滴度肺指數(shù)(×10-3)對(duì)照組12-6.42±0.47模型組124.37±0.0616.38±0.94a柴葛低劑量組123.34±0.11b12.01±0.78ab柴葛高劑量組122.15±0.07bc8.26±0.25abc利巴韋林組123.24±0.09bd11.73±0.71abdF值1 377.059388.068P值<0.001<0.001

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柴葛低劑量組比較，cP<0.05；與柴葛高劑量組比較，dP<0.05

表2各組肺組織病理學(xué)評(píng)分比較

組 別n病理學(xué)評(píng)分對(duì)照組120.73±0.11模型組1225.46±1.27a柴葛低劑量組1213.94±0.72ab柴葛高劑量組128.64±0.38abc利巴韋林組1214.35±0.69abdF值1 773.654P值<0.001

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柴葛低劑量組比較，cP<0.05；與柴葛高劑量組比較，dP<0.05

2.3 各組外周血Th17和Treg細(xì)胞表達(dá)水平比較

模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組Th17細(xì)胞表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，Treg細(xì)胞表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)；柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組Th17細(xì)胞低于模型組(P<0.05)，Treg細(xì)胞高于模型組(P<0.05)；柴葛高劑量組Th17細(xì)胞低于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05)，Treg細(xì)胞高于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05)；柴葛低劑量組和利巴韋林組Th17、Treg細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3各組外周血Th17和Treg細(xì)胞表達(dá)水平比較

組 別nTh17細(xì)胞/%Treg細(xì)胞/%對(duì)照組122.87±0.7680.31±1.57模型組125.31±1.63a5.94±0.33a柴葛低劑量組124.27±1.42ab55.36±1.24ab柴葛高劑量組123.29±1.25abc66.78±1.35abc利巴韋林組124.35±1.38abd55.94±1.31abdF值6.3516 204.886P值<0.001<0.001

與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05；與柴葛低劑量組比較，cP<0.05；與柴葛高劑量組比較，dP<0.05

2.4 各組細(xì)胞因子水平比較

模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組IL- 4、IL- 17水平高于對(duì)照組(P<0.05)，IL- 10、TGF- β水平低于對(duì)照組(P<0.05)；柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組IL- 4、IL- 17水平低于模型組(P<0.05)，IL- 10、TGF- β水平高于模型組(P<0.05)；柴葛高劑量組IL- 4、IL- 17水平低于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05)，IL- 10、TGF- β水平高于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05)；柴葛低劑量組和利巴韋林組IL- 4、IL- 10、IL- 17、TGF- β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4各組細(xì)胞因子水平比較

組 別nIL-4/pg·ml-1IL-10/pg·ml-1IL-17/pg·ml-1TGF-β/pg·ml-1對(duì)照組1212.37±2.64131.24±17.6441.29±12.302 301.26±561.34模型組1258.78±6.79a85.27±12.43a72.37±16.37a1 324.15±341.28a柴葛低劑量組1244.49±4.25ab96.45±11.29ab60.34±14.13ab1 712.03±329.14ab柴葛高劑量組1229.61±4.26abc121.25±13.48abc53.26±13.41abc1 947.25±412.37abc利巴韋林組1245.16±3.67abd97.18±10.28abd61.64±13.18abd1 756.28±311.24abdF值182.83625.0088.1249.458P值<0.001<0.001<0.001<0.001

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與柴葛低劑量組比較，cP<0.05；與柴葛高劑量組比較，dP<0.05

3 討 論

嬰幼兒RSV感染可引起嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎，患兒大多1歲以前感染過(guò)RSV病毒，RSV病毒感染是引起兒童反復(fù)發(fā)生哮喘和喘息的重要因素，不僅是嬰幼兒，RSV病毒可引起所有年齡段人群呼吸道感染[4]。RSV病毒侵入人體后既是過(guò)敏原，又是感染原，RSV病毒感染可引起氣道高反應(yīng)性和氣道變異性炎癥反應(yīng)，并可引起機(jī)體免疫狀態(tài)發(fā)生變化，加重哮喘的發(fā)生[5]。

RSV感染引起的毛細(xì)支氣管炎尚無(wú)安全的特效藥，中醫(yī)藥在RSV感染的防治方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，中藥毒副作用小、療效確切、價(jià)格低廉、藥源豐富，在調(diào)節(jié)免疫功能、阻止病毒引起細(xì)胞病變、抑制病毒復(fù)制、改善臨床癥狀等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[6- 7]。柴葛口服液是在“小柴胡湯”和“銀翹散”化載的“柴葛退熱湯”的基礎(chǔ)上改良制成，其成分為葛根、柴胡、板藍(lán)根、金銀花、菊花、連翹、甘草、竹葉等，其中柴胡、板藍(lán)根、金銀花、菊花、連翹、甘草都有抗RSV感染的作用[8]。柴葛退熱湯具有宣肺通竅、清熱解表等功效，對(duì)細(xì)菌或病毒引起的腮腺炎、上呼吸道感染等療效確切，但湯劑質(zhì)量不穩(wěn)定，應(yīng)用不方便，針對(duì)兒童服藥困難的特點(diǎn)將其改良為柴葛口服液，柴葛口服液口感好、服用方便、質(zhì)量穩(wěn)定[9]。本研究用RSV建立小鼠毛細(xì)支氣管炎模型，給予柴葛口服液治療，并以常用抗病毒藥利巴韋林作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察柴葛口服液對(duì)毛細(xì)支氣管炎的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組小鼠病毒滴度、肺指數(shù)、肺組織病理學(xué)評(píng)分均明顯升高，柴葛口服液和利巴韋林治療可明顯降低模型小鼠的病毒滴度、肺指數(shù)和肺組織病理學(xué)評(píng)分，其中低劑量柴葛口服液和利巴韋林療效相當(dāng)，高劑量柴葛口服液療效優(yōu)于低劑量柴葛口服液和利巴韋林，可見(jiàn)，柴葛口服液對(duì)毛細(xì)支氣管炎的治療效果確切。

免疫反應(yīng)在RSV病毒感染中具有重要作用，其中Th1/Th2平衡假說(shuō)占據(jù)主導(dǎo)地位，Th1細(xì)胞可分泌IFN- γ、IL- 2等細(xì)胞因子引起細(xì)胞毒作用和活化巨噬細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[10- 11]；Th2細(xì)胞可分泌IL- 4，活化免疫球蛋白，參與體液免疫；RSV感染可使特異性T細(xì)胞獲得Th2細(xì)胞，分泌IL- 4，增強(qiáng)IgE抗體的產(chǎn)生，表明Th1/Th2細(xì)胞因子免疫平衡失調(diào)在RSV感染中發(fā)揮重要作用[12- 14]。Treg/Th17平衡在免疫調(diào)節(jié)中也具有重要作用，Th17細(xì)胞主要分泌IL- 17，可引起多種細(xì)胞表達(dá)IL- 6、TGF- β、粒細(xì)胞集落刺激因子等多種細(xì)胞因子和炎癥趨化因子。在RSV感染中Th17及其分泌的細(xì)胞因子IL- 17水平上升[15- 16]；Treg主要分泌IL- 10和TGF- β，在RSV引起毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生發(fā)展中，Treg可能引起Th2應(yīng)答增強(qiáng)，促進(jìn)Th17分泌IL- 17，從而引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。本研究結(jié)果表明：模型組小鼠Th17細(xì)胞、IL- 4、IL- 17水平升高，Treg細(xì)胞、IL- 10、TGF- β水平降低；柴葛口服液和利巴韋林可降低模型小鼠Th17細(xì)胞、IL- 4、IL- 17水平，升高Treg細(xì)胞、IL- 10、TGF- β水平，其中柴葛口服液低劑量和利巴韋林對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用相當(dāng)，柴葛口服液高劑量對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于柴葛口服液低劑量和利巴韋林。柴葛口服液對(duì)毛細(xì)支氣管炎的治療作用可能與其對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，毛細(xì)支氣管炎存在Th1/Th2平衡失調(diào)和Treg/Th17平衡失調(diào)，柴葛口服液可通過(guò)降低Th17細(xì)胞、IL- 4、IL- 17水平，升高Treg細(xì)胞、IL- 10、TGF- β水平，發(fā)揮對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用，從而起到治療毛細(xì)支氣管炎的效果。