秦小菀,惠曉霞,高偉霞,郭潔,金志鵬
(1.河南省南陽市中心醫(yī)院 兒科急診,河南 南陽 473000;2.鄭州兒童醫(yī)院 兒科,河南 鄭州 450053)
毛細(xì)支氣管炎多發(fā)生在2歲以內(nèi)小兒,是嬰幼兒常見的呼吸道疾病之一,多由呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染引起,咳嗽、喘憋和“三凹征”為其主要臨床表現(xiàn),是肺炎的一種特殊類型,臨床治療上尚無特效藥物[1- 2]。柴葛口服液(葛根、柴胡、板藍(lán)根、金銀花、菊花、連翹、甘草、竹葉等組成)中的中藥成分對細(xì)菌、病毒感染引起的腮腺炎、上呼吸道感染等療效確切[3]。柴葛口服液對毛細(xì)支氣管炎免疫功能的作用尚不清楚。本研究采用RSV感染建立毛細(xì)支氣管炎小鼠模型,并給予柴葛口服液治療,以利巴韋林為陽性對照,觀察柴葛口服液對毛細(xì)支氣管炎小鼠的治療作用及對免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
實驗動物:雌性、清潔級BALB/c小鼠60只,體重19~23 g,購自北京市醫(yī)療器械檢驗所,許可證號:SYXK(京)2015- 0006,飼養(yǎng)于河南省南陽市中心醫(yī)院動物實驗中心。病毒和細(xì)胞:RSV病毒A亞型(首都兒科研究所),Hep- 2細(xì)胞株(西京醫(yī)院兒科實驗室)。主要藥物:柴葛口服液(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨床藥學(xué)室研制,批號20170122,含葛根素10 mg·ml-1、柴胡皂苷3 mg·ml-1),利巴韋林注射液(上?,F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司,批號20150326,規(guī)格5 ml∶0.5 g)。主要試劑和儀器:RPMI 1640培養(yǎng)液、多聚甲醛、胰蛋白酶、小牛血清(美國Sigma公司),ELISA試劑盒、流式細(xì)胞儀(美國R&D公司)。
1.2.1 小鼠分組及毛細(xì)支氣管炎模型制備 將60只小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組,每組12只。除對照組外,其它各組均建立毛細(xì)支氣管炎小鼠模型。建模方法:小鼠麻醉成功后順小鼠鼻腔滴入RSV病毒液100 μl,滴鼻后保持小鼠頭部后仰1 min使RSV病毒液流入小鼠支氣管、氣管部位,1次·d-1,共2 d;對照組同法用等量生理鹽水滴鼻,1次·d-1,共2 d。
1.2.2 各組小鼠處理 感染病毒后,柴葛低劑量組和柴葛高劑量組分別給予柴葛口服液低劑量(根據(jù)柴葛中葛根素含量按臨床用量計)(5.18 mg·kg-1·d-1)和高劑量(23.1 mg·kg-1·d-1)灌胃治療,1次·d-1;利巴韋林組給予利巴韋林10 mg·kg-1·d-1灌胃治療,1次·d-1;對照組和模型組給予0.5 ml生理鹽水灌胃,1次·d-1;共7 d。7 d后采集各組小鼠外周血,然后處死小鼠用于實驗。
1.2.3 肺組織病毒滴度測定 取小鼠肺組織勻漿,勻漿液2 500 r·min-1離心15 min,收集上清液,用病毒維持液稀釋肺組織上清液成不同梯度,將Hep- 2細(xì)胞接種到96孔板中,每孔細(xì)胞接種10-1~10-8濃度上清液,并設(shè)立陰性對照,每天顯微鏡下觀察細(xì)胞情況,計算第7天時病毒滴度。
1.2.4 肺指數(shù)測定 處死前稱取小鼠體重,取各組小鼠肺組織稱肺組織重量,小鼠肺指數(shù)=小鼠肺組織重量/小鼠體重。
1.2.5 肺組織病理學(xué)評分測定 取各組小鼠肺組織,采用常規(guī)HE染色,光鏡下觀察小鼠肺組織HE染色情況并拍照,計算小鼠肺組織病理學(xué)評分(1~2分不可能,3~4分可能,5~6分很可能,7分極可能,8~9分明確):分別從肺實質(zhì)肺炎程度、血管周圍浸潤范圍、細(xì)支氣管腔滲出程度、細(xì)支氣管及支氣管周圍浸潤程度及范圍對小鼠肺組織劃分等級和累計評分,總分0~26分,評分越高,小時肺部炎性損傷程度越重。
1.2.6 外周血輔助性T細(xì)胞17(helper T cells 17,Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)測定 采用流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠外周血Th17和Treg細(xì)胞表達(dá)水平。
1.2.7 血清白細(xì)胞介素- 4(Interleukin- 4,IL- 4)、白細(xì)胞介素- 10(Interleukin- 10,IL- 10)、白細(xì)胞介素- 17(Interleukin- 4- 17,IL- 17)、轉(zhuǎn)化生長因子- β(transforming growth factor- beta,TGF- β)水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme- linked immunosorbent assay,ELISA)法測定各組小鼠血清IL- 4、IL- 10、IL- 17、TGF- β水平。
模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組肺指數(shù)均高于對照組(P<0.05),柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組病毒滴度和肺指數(shù)均低于模型組(P<0.05),柴葛高劑量組病毒滴度和肺指數(shù)低于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05),柴葛低劑量組和利巴韋林組病毒滴度和肺指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組肺病理學(xué)評分均高于對照組(P<0.05),柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組肺病理學(xué)評分均低于模型組(P<0.05),柴葛高劑量組肺病理學(xué)評分低于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05),柴葛低劑量組和利巴韋林組肺病理學(xué)評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表1各組肺組織病毒滴度和肺指數(shù)比較
組 別n病毒滴度肺指數(shù)(×10-3)對照組12-6.42±0.47模型組124.37±0.0616.38±0.94a柴葛低劑量組123.34±0.11b12.01±0.78ab柴葛高劑量組122.15±0.07bc8.26±0.25abc利巴韋林組123.24±0.09bd11.73±0.71abdF值1 377.059388.068P值<0.001<0.001
與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與柴葛低劑量組比較,cP<0.05;與柴葛高劑量組比較,dP<0.05
表2各組肺組織病理學(xué)評分比較
組 別n病理學(xué)評分對照組120.73±0.11模型組1225.46±1.27a柴葛低劑量組1213.94±0.72ab柴葛高劑量組128.64±0.38abc利巴韋林組1214.35±0.69abdF值1 773.654P值<0.001
與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與柴葛低劑量組比較,cP<0.05;與柴葛高劑量組比較,dP<0.05
模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組Th17細(xì)胞表達(dá)水平高于對照組(P<0.05),Treg細(xì)胞表達(dá)水平低于對照組(P<0.05);柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組Th17細(xì)胞低于模型組(P<0.05),Treg細(xì)胞高于模型組(P<0.05);柴葛高劑量組Th17細(xì)胞低于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05),Treg細(xì)胞高于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05);柴葛低劑量組和利巴韋林組Th17、Treg細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。
表3各組外周血Th17和Treg細(xì)胞表達(dá)水平比較
組 別nTh17細(xì)胞/%Treg細(xì)胞/%對照組122.87±0.7680.31±1.57模型組125.31±1.63a5.94±0.33a柴葛低劑量組124.27±1.42ab55.36±1.24ab柴葛高劑量組123.29±1.25abc66.78±1.35abc利巴韋林組124.35±1.38abd55.94±1.31abdF值6.3516 204.886P值<0.001<0.001
與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與柴葛低劑量組比較,cP<0.05;與柴葛高劑量組比較,dP<0.05
模型組、柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組IL- 4、IL- 17水平高于對照組(P<0.05),IL- 10、TGF- β水平低于對照組(P<0.05);柴葛低劑量組、柴葛高劑量組、利巴韋林組IL- 4、IL- 17水平低于模型組(P<0.05),IL- 10、TGF- β水平高于模型組(P<0.05);柴葛高劑量組IL- 4、IL- 17水平低于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05),IL- 10、TGF- β水平高于柴葛低劑量組和利巴韋林組(P<0.05);柴葛低劑量組和利巴韋林組IL- 4、IL- 10、IL- 17、TGF- β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。
表4各組細(xì)胞因子水平比較
組 別nIL-4/pg·ml-1IL-10/pg·ml-1IL-17/pg·ml-1TGF-β/pg·ml-1對照組1212.37±2.64131.24±17.6441.29±12.302 301.26±561.34模型組1258.78±6.79a85.27±12.43a72.37±16.37a1 324.15±341.28a柴葛低劑量組1244.49±4.25ab96.45±11.29ab60.34±14.13ab1 712.03±329.14ab柴葛高劑量組1229.61±4.26abc121.25±13.48abc53.26±13.41abc1 947.25±412.37abc利巴韋林組1245.16±3.67abd97.18±10.28abd61.64±13.18abd1 756.28±311.24abdF值182.83625.0088.1249.458P值<0.001<0.001<0.001<0.001
與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與柴葛低劑量組比較,cP<0.05;與柴葛高劑量組比較,dP<0.05
嬰幼兒RSV感染可引起嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎,患兒大多1歲以前感染過RSV病毒,RSV病毒感染是引起兒童反復(fù)發(fā)生哮喘和喘息的重要因素,不僅是嬰幼兒,RSV病毒可引起所有年齡段人群呼吸道感染[4]。RSV病毒侵入人體后既是過敏原,又是感染原,RSV病毒感染可引起氣道高反應(yīng)性和氣道變異性炎癥反應(yīng),并可引起機(jī)體免疫狀態(tài)發(fā)生變化,加重哮喘的發(fā)生[5]。
RSV感染引起的毛細(xì)支氣管炎尚無安全的特效藥,中醫(yī)藥在RSV感染的防治方面具有明顯優(yōu)勢,中藥毒副作用小、療效確切、價格低廉、藥源豐富,在調(diào)節(jié)免疫功能、阻止病毒引起細(xì)胞病變、抑制病毒復(fù)制、改善臨床癥狀等方面具有獨特優(yōu)勢[6- 7]。柴葛口服液是在“小柴胡湯”和“銀翹散”化載的“柴葛退熱湯”的基礎(chǔ)上改良制成,其成分為葛根、柴胡、板藍(lán)根、金銀花、菊花、連翹、甘草、竹葉等,其中柴胡、板藍(lán)根、金銀花、菊花、連翹、甘草都有抗RSV感染的作用[8]。柴葛退熱湯具有宣肺通竅、清熱解表等功效,對細(xì)菌或病毒引起的腮腺炎、上呼吸道感染等療效確切,但湯劑質(zhì)量不穩(wěn)定,應(yīng)用不方便,針對兒童服藥困難的特點將其改良為柴葛口服液,柴葛口服液口感好、服用方便、質(zhì)量穩(wěn)定[9]。本研究用RSV建立小鼠毛細(xì)支氣管炎模型,給予柴葛口服液治療,并以常用抗病毒藥利巴韋林作為陽性對照,觀察柴葛口服液對毛細(xì)支氣管炎的治療效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn):模型組小鼠病毒滴度、肺指數(shù)、肺組織病理學(xué)評分均明顯升高,柴葛口服液和利巴韋林治療可明顯降低模型小鼠的病毒滴度、肺指數(shù)和肺組織病理學(xué)評分,其中低劑量柴葛口服液和利巴韋林療效相當(dāng),高劑量柴葛口服液療效優(yōu)于低劑量柴葛口服液和利巴韋林,可見,柴葛口服液對毛細(xì)支氣管炎的治療效果確切。
免疫反應(yīng)在RSV病毒感染中具有重要作用,其中Th1/Th2平衡假說占據(jù)主導(dǎo)地位,Th1細(xì)胞可分泌IFN- γ、IL- 2等細(xì)胞因子引起細(xì)胞毒作用和活化巨噬細(xì)胞,介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[10- 11];Th2細(xì)胞可分泌IL- 4,活化免疫球蛋白,參與體液免疫;RSV感染可使特異性T細(xì)胞獲得Th2細(xì)胞,分泌IL- 4,增強(qiáng)IgE抗體的產(chǎn)生,表明Th1/Th2細(xì)胞因子免疫平衡失調(diào)在RSV感染中發(fā)揮重要作用[12- 14]。Treg/Th17平衡在免疫調(diào)節(jié)中也具有重要作用,Th17細(xì)胞主要分泌IL- 17,可引起多種細(xì)胞表達(dá)IL- 6、TGF- β、粒細(xì)胞集落刺激因子等多種細(xì)胞因子和炎癥趨化因子。在RSV感染中Th17及其分泌的細(xì)胞因子IL- 17水平上升[15- 16];Treg主要分泌IL- 10和TGF- β,在RSV引起毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生發(fā)展中,Treg可能引起Th2應(yīng)答增強(qiáng),促進(jìn)Th17分泌IL- 17,從而引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。本研究結(jié)果表明:模型組小鼠Th17細(xì)胞、IL- 4、IL- 17水平升高,Treg細(xì)胞、IL- 10、TGF- β水平降低;柴葛口服液和利巴韋林可降低模型小鼠Th17細(xì)胞、IL- 4、IL- 17水平,升高Treg細(xì)胞、IL- 10、TGF- β水平,其中柴葛口服液低劑量和利巴韋林對免疫的調(diào)節(jié)作用相當(dāng),柴葛口服液高劑量對免疫的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于柴葛口服液低劑量和利巴韋林。柴葛口服液對毛細(xì)支氣管炎的治療作用可能與其對免疫功能的調(diào)節(jié)作用有關(guān),毛細(xì)支氣管炎存在Th1/Th2平衡失調(diào)和Treg/Th17平衡失調(diào),柴葛口服液可通過降低Th17細(xì)胞、IL- 4、IL- 17水平,升高Treg細(xì)胞、IL- 10、TGF- β水平,發(fā)揮對免疫功能的調(diào)節(jié)作用,從而起到治療毛細(xì)支氣管炎的效果。