李利波，曹輝，張紅麗，潘婭

(1．貴州省人民醫(yī)院 腫瘤科，貴州 貴陽 550002；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550002)

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤惡化的一個重要標(biāo)志。而在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用的就是腫瘤細(xì)胞突破基底膜(basement membrane，BM)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)組成的屏障[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)合成的場所，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)出現(xiàn)發(fā)生錯誤折疊或者沒有折疊的蛋白質(zhì)超量積累時，會激活細(xì)胞中一些信號通路，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[2]。許多癌癥相關(guān)的病理與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的失衡以及誘導(dǎo)ERS和未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response UPR)途徑有關(guān)[3- 4]。目前，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose- regulated protein 78，GRP78)常被視為腫瘤治療反應(yīng)的一種特異性標(biāo)志物[5- 6]，生長停滯及DNA損傷誘導(dǎo)基因153(CHOP)為ERS凋亡途徑被激活的主要標(biāo)志之一[7- 9]，X- 盒- 結(jié)合蛋白- 1(X box- binding protein- 1，XBP- 1)的表達(dá)上調(diào)為ERS標(biāo)志[10- 11]。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一[12]，它是促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中二硫鍵形成的蛋白酶。當(dāng)PDI減少時，錯誤折疊的蛋白質(zhì)增多且細(xì)胞凋亡程序啟動，促進細(xì)胞死亡[13- 14]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑及設(shè)備

正常肝細(xì)胞LO2、人肝癌細(xì)胞系SMMC- 7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞(上海生命科學(xué)研究所)，RIPA裂解液和BCA Protein Assay KitP0010S(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，CHOP和PDI以及GRP78抗體和XBP- 1抗體(ABCAM公司)，P- 40裂解液和RIPA裂解液WB- 0071(上海鼎國生物技術(shù)有限公司)，KitM3121/1859022/ECL- PLUS和Prestained protein marker 00161543(Termo)。X線膠片顯影粉和定影粉(上海冠龍照相材料廠)，醫(yī)用X光片038401501(Crestream)，PVDF膜IPVH00010(Mllipore)，SDS- PAGE蛋白電泳儀VE- 180、穩(wěn)壓電源(電泳用)EPS- 300和蛋白轉(zhuǎn)膜儀VE- 186(上海天能公司)。熒光顯微鏡IX71(奧林帕斯公司)，離心機Fresco 21為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡XDS- 100為上海蔡康光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱MCO- 15A為SANYO產(chǎn)品，96 Wounding和Replicator VP408FH為VP scientific公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝細(xì)胞LO2培養(yǎng)條件：在37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+10%胎牛血清；人肝癌細(xì)胞系HepG2培養(yǎng)條件：在37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+10%胎牛血清；人肝癌細(xì)胞系SMMC- 7721細(xì)胞培養(yǎng)條件：在37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為RMPI 1640+10%胎牛血清。3種細(xì)胞均按照1∶3～1∶6傳代后提取細(xì)胞樣品，PBS洗滌兩次后轉(zhuǎn)移入EP管中，在冰上裂解15 min，裂解結(jié)束后用超聲波將細(xì)胞打碎，用離心機離心15 min，得到的上清液即為蛋白樣品。

1.2.2 誘導(dǎo)ERS 取培養(yǎng)獲得的正常肝細(xì)胞LO2及肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和SMMC- 7721細(xì)胞，將濃度為150 mmol·L-1的無水乙醇加入到HepG2、LO2和SMMC- 7721細(xì)胞中，作用48 h。將無水乙醇棄掉，然后用PBS洗滌2次，從而得到經(jīng)過無水乙醇進行誘導(dǎo)發(fā)生ERS的HepG2、LO2和SMMC- 7721細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞裂解液中GRP78、CHOP、XBP- 1及PDI表達(dá)的測定 分別將獲得的正常肝細(xì)胞LO2、人肝癌細(xì)胞系HepG2及SMMC- 7721細(xì)胞，以及無水乙醇誘導(dǎo)發(fā)生ERS的3種細(xì)胞樣品，用PBS洗滌兩次后轉(zhuǎn)移入EP管中，在冰上進行裂解，裂解時間為15 min，裂解結(jié)束后用超聲波將細(xì)胞打碎，用離心機離心15 min，得到的上清液即為蛋白樣品。將蛋白樣品上樣，恒壓80 V電泳2 h，4 ℃、 恒流為300 mA的條件下進行電轉(zhuǎn)150 min，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用封閉液(封閉液為含5%脫脂牛奶的TBST溶液)封閉PVDF膜，封閉時間為1 h，然后4 ℃過夜；用TBST洗膜3次，每次洗滌時間為10 min；用Western blotting system試劑盒進行顯色，檢測GRP78、CHOP、XBP- 1及PDI表達(dá)。

1.2.4 LV- PDIA2(9923- 1)病毒轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)獲得的正常肝細(xì)胞LO2、肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和SMMC- 7721細(xì)胞，分別加LV- PDIA2(9923- 1)10 μl和病毒CON145(陰性對照)感染細(xì)胞。在感染16 h后將培養(yǎng)基更換為常規(guī)培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)，以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)為熒光標(biāo)記慢病毒感染，72 h時用熒光顯微鏡觀察報告基因的表達(dá)情況，熒光率即為陽性感染率。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測 取感染前LO2、HepG2及SMMC- 7721細(xì)胞及病毒轉(zhuǎn)染后的3種細(xì)胞約3×104個分別加入含有胎牛血清培養(yǎng)基的96孔板上，次日將培養(yǎng)基換成血清濃度較低的培養(yǎng)基，保持劃痕儀和96孔板的下端中央部位對齊，用力向上輕輕一推形成劃痕。然后用無血清培養(yǎng)基進行漂洗，漂洗2～3遍后在培養(yǎng)基中加入血清濃度較低的培養(yǎng)基(如0.5% FBS)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0、8、24 h拍照，觀察細(xì)胞遷移能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21軟件進行統(tǒng)計分析，采用非參數(shù)檢驗和one- way ANOVA法分析無水乙醇處理前后3種細(xì)胞中GRP78和PDI、CHOP、XBP- 1蛋白表達(dá)，t檢驗分析3種細(xì)胞的遷移能力在病毒轉(zhuǎn)染前后改變，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GRP78、CHOP、XBP- 1在ERS前后的表達(dá)

Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，無水乙醇處理后LO2、HepG2及SMMC- 7721細(xì)胞中GRP78、XBP- 1光密度值升高(圖1、2，表1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示3種細(xì)胞經(jīng)無水乙醇處理后發(fā)生了ERS；無水乙醇處理后，LO2及SMMC- 7721中CHOP的光密度值也增高(圖3、4，表1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但無水乙醇處理前后HepG2細(xì)胞中均無CHOP表達(dá)。

2.2 PDI在ERS前后的表達(dá)

Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)無水乙醇處理前，在SMMC- 7721細(xì)胞中PDI的光密度值最高，其次LO2細(xì)胞，在HepG2細(xì)胞中最低，3種細(xì)胞比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在無水乙醇處理48 h后，PDI在3種細(xì)胞中的光密度值均下降，光密度值從高到低仍然是SMMC- 7721、LO2、HepG2，3種細(xì)胞分別與無水乙醇處理前比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、6，表2。

圖1無水乙醇處理前后3種細(xì)胞中GRP78、XBP-1表達(dá)

Fig1TheexpressionofGRP78andXBP-1inthreekindsofcellsbeforeandafterethanoltreatment

與無水乙醇處理前相比，aP<0.05

圖2無水乙醇處理前后3種細(xì)胞中GRP78、XBP-1表達(dá)

Fig2TheexpressionofGRP78inthreekindsofcellsbeforeandafterethanoltreatment

表1無水乙醇處理前后3種細(xì)胞GRP78、XBP-1、CHOP光密度值

Tab1ThedensityofGRP78、XBP-1、CHOPinthreekindsofcellsbeforeandafterethanoltreatment

細(xì) 胞蛋 白光密度值無水乙醇處理前無水乙醇處理48 hP值LO2GRP780.74±0.181.07±0.24<0.05HepG20.90±0.141.17±0.17<0.05SMMC-77210.75±0.170.29±0.06<0.05LO2XBP-11.16±0.221.29±0.250.087HepG20.98±0.171.08±0.280.028SMMC-77210.64±0.210.92±0.170.030LO2CHOP0.98±0.160.99±0.170.042SMMC-77210.89±0.160.95±0.170.042

圖3無水乙醇處理前后2種細(xì)胞中CHOP表達(dá)

Fig3TheexpressionofCHOPintwokindsofcellsbeforeandafterethanoltreatment

與無水酒精處理前相比， aP<0.05

圖4無水乙醇處理前后LO2和SMMC-7721細(xì)胞中的CHOP表達(dá)

Fig4TheexpressionofCHOPinLO2cellandSMMC-7721cellbeforeandafterethanoltreatment

2.3 PDI對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響

病毒轉(zhuǎn)染前3種細(xì)胞中HepG2細(xì)胞遷移能力最弱，其次為LO2，遷移能力最強的為SMMC- 7721細(xì)胞。感染病毒使PDI過表達(dá)后，SMMC- 7721細(xì)胞遷移能力最強，其次為LO2細(xì)胞，HepG2細(xì)胞遷移能力最弱；與PDI過表達(dá)前比較，LO2細(xì)胞遷移能力受到了抑制，而HepG2細(xì)胞與SMMC- 7721細(xì)胞遷移能力得到了增強。見圖7、8，表3。

3 討 論

原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的改變是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的前提。由于腫瘤處于一種高度細(xì)胞分裂增殖的狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)供應(yīng)不夠，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞長期處于缺氧狀態(tài)。而腫瘤細(xì)胞缺氧正是ERS的一種強誘導(dǎo)劑，所以，腫瘤組織中有ERS。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊、組裝、運輸以及參與脂質(zhì)代謝的場所，并且也儲存細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子，細(xì)胞中存在一完整機制來促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生折疊和修飾。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)生理功能發(fā)生紊發(fā)生紊亂等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還可通過促進凋亡反應(yīng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也可以通過抗凋亡作用而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生無限增殖。腫瘤細(xì)胞還可以激活未折疊蛋白反應(yīng)，從而增強生長因子、血管生成因子和細(xì)胞因子分泌的能力，從而促進腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[15- 16]。ERS發(fā)生時UPR還可以通過影響血管因子的表達(dá)促進腫瘤新生血管的生成，許多癌癥相關(guān)的病理與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的失衡以及誘導(dǎo)ERS和UPR途徑有關(guān)，這使得ERS成為近年來腫瘤治療的一個新靶點，目前通常采用參與未折疊蛋白反應(yīng)的標(biāo)志性分子，如GRP78、CHOP、XBP- 1等表達(dá)水平上調(diào)來提示ERS的發(fā)生[15- 16]。本研究結(jié)果提示，正常肝細(xì)胞LO2、肝癌細(xì)胞HepG2及高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞SMMC- 7721經(jīng)無水乙醇處理48 h，細(xì)胞中ERS標(biāo)志物GRP78、CHOP、XBP- 1的表達(dá)都發(fā)生改變(HepG2細(xì)胞中CHOP除外)，提示經(jīng)無水乙醇處理48 h的3種細(xì)胞都發(fā)生了ERS。PDI是附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔面上的一種氧化還原酶，它可以切斷二硫鍵，形成自由能最低的蛋白質(zhì)構(gòu)象，從而幫助新生蛋白質(zhì)產(chǎn)生正確折疊的構(gòu)象，還可充當(dāng)分子伴侶，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種重要的折疊催化劑[17]。PDI可以通過介導(dǎo)氧化蛋白的折疊來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，研究表明，PDI在多種癌癥的生存和發(fā)展中起到重要作用[18]。在本研究中，無水乙醇處理前3種細(xì)胞中都有PDI表達(dá)，表達(dá)量高低依次是SMMC- 772、LO2、HepG2細(xì)胞，說明腫瘤細(xì)胞的惡性程度越高，PDI表達(dá)越明顯。處理48 h后PDI的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，表達(dá)量高低順序仍然依次是SMMC- 772、LO2、HepG2細(xì)胞，提示PDI表達(dá)可能影響SMMC- 7721的轉(zhuǎn)移能力，表明在肝癌細(xì)胞中ERS可以促使PDI進入細(xì)胞質(zhì)，使得PDI減少，增加錯誤折疊的蛋白質(zhì)，進而使癌細(xì)胞保持在ERS狀態(tài)，啟動凋亡程序，從而促進細(xì)胞死亡。處理前后PDI表達(dá)水平不同與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，因此需要觀察PDI過表達(dá)對肝癌細(xì)胞的遷移率的影響。在病毒轉(zhuǎn)染前3種細(xì)胞細(xì)胞遷徙能力順序依次是SMMC- 772、LO2、HepG2細(xì)胞，病毒感染后3種細(xì)胞遷徙能力順序依次是SMMC- 772、LO2、HepG2細(xì)胞。與感染前比較，LO2細(xì)胞遷移能力受到了抑制，而HepG2細(xì)胞與SMMC- 7721細(xì)胞遷移能力得到了增強，且隨著細(xì)胞惡性程度的增加而增強。這提示肝癌細(xì)胞的遷移能力受到PDI的影響，PDI過表達(dá)可以促進肝癌細(xì)胞的遷移能力，因此這兩種肝癌細(xì)胞都表現(xiàn)出遷移傾向加強。有文獻(xiàn)顯示，PDI靜默可以通過降低氧自由基而降低血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常的生理功能與氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)，越來越多的研究證明ROS和RNS在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中起著介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用[19- 20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提供一個獨特的氧化環(huán)境促進蛋白質(zhì)二硫鍵形成，進而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成ROS，腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境呈現(xiàn)出低氧、低營養(yǎng)和低pH值的狀態(tài)，存在錯誤折疊的蛋白質(zhì)，PDI可切斷錯誤折疊的蛋白質(zhì)二硫鍵，形成自由能最低的蛋白質(zhì)構(gòu)象，幫助形成新的二硫鍵并產(chǎn)生正確折疊的構(gòu)象，蛋白質(zhì)的折疊和重折疊需要消耗大量ATP，ATP耗竭導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊刺激線粒體氧化磷酸化增加ATP和ROS的產(chǎn)生，進而增加腫瘤細(xì)胞遷移能力[21- 22]。且PDI增加越多，ROS形成越多，肝癌細(xì)胞遷移能力增強的程度越大。而在正常肝細(xì)胞中，穩(wěn)定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境的可以使PDI介導(dǎo)錯誤氧化的蛋白質(zhì)進行二硫化物重組，使ROS減少，從而抑制細(xì)胞遷徙能力[23]。

圖5無水乙醇處理前后3種細(xì)胞中PDI表達(dá)

Fig5TheexpressionofPDIinthreekindsofcellsbeforeandafterethanoltreatment

與無水酒精處理前相比，aP<0.05

圖6無水乙醇處理前后3種細(xì)胞中PDI表達(dá)

Fig6TheexpressionofPDIinthreekindsofcellsbeforeandafterethanoltreatment

表2無水乙醇處理前后3種細(xì)胞PDI光密度值

Tab2ThedensityofPDIinthreekindsofcellsbeforeandafterethanoltreatment

細(xì) 胞PDI光密度值無水乙醇處理前無水乙醇處理48 hP值LO20.93±0.100.58±0.170.049HepG20.81±0.210.48±0.140.003SMMC-77211.20±0.281.00±0.290.032

圖7病毒感染前后3種細(xì)胞遷移能力(0h，24h)

Fig7Themigrationabilityofthreekindsofcellsbeforeandaftervirustransfection(0h，24h)

與轉(zhuǎn)染前相比，aP<0.05

圖8病毒感染前后3種細(xì)胞遷移能力

Fig8Themigrationabilityofthreekindsofcellsbeforeandaftervirustransfection

表3病毒轉(zhuǎn)染前后3種細(xì)胞遷移率

Tab3Themigrationabilityofthreekindsofcellsbeforeandaftervirustransfection

細(xì)胞遷移率轉(zhuǎn)染前0 h轉(zhuǎn)染后24 hP值LO20.25±0.050.23±0.070.03HepG20.04±0.010.06±0.010.03SMMC-77210.74±0.210.95±0.070.028

亂時，將導(dǎo)致ERS一系列反應(yīng)出現(xiàn)，包括蛋白質(zhì)翻譯停滯、蛋白質(zhì)折疊能力增強、蛋白質(zhì)的降解加速或者細(xì)胞內(nèi)Ca2+

ERS標(biāo)志物GRP78、CHOP、XBP- 1及PDI在正常肝細(xì)胞LO2中都具有一定的表達(dá)，而無論是在肝癌HepG2細(xì)胞還是高轉(zhuǎn)移能力的肝癌SMMC- 7721細(xì)胞中ERS標(biāo)志物的表達(dá)水平均與正常肝細(xì)胞不同，提示正常肝細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞的ERS反應(yīng)程度不同。無水乙醇處理前后SMMC- 7721的PDI表達(dá)水平在3種細(xì)胞中最高，轉(zhuǎn)染病毒使PDI過表達(dá)時，SMMC- 7721細(xì)胞的遷移能力明顯增強，提示PDI表達(dá)水平升高與腫瘤的高轉(zhuǎn)移能力有關(guān)[24- 29]。