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(1.華東師范大學(xué)物理與材料學(xué)院，上海市磁共振重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062； 2.蘇州博創(chuàng)同康生物工程有限公司，江蘇 蘇州 215300)

1 前 言

1955年Vanderhoff[1]等成功地合成了單分散的聚苯乙烯微球，開辟了高分子科學(xué)的新研究領(lǐng)域。高分子微球不僅有固相化載體特有的易于分離和提取的優(yōu)點(diǎn)，還具有廉價(jià)、比表面積大、單分散性好、易于制備及功能化等特點(diǎn)[2]。目前，高分子微球已廣泛運(yùn)用于材料科學(xué)，化學(xué)工程等領(lǐng)域[3]。

聚乙烯醇是一種由聚醋酸乙烯醇解而得到的水溶性高分子，它是一種水溶性高分子材料，具有良好的成膜性及成膜后的抗拉強(qiáng)度、耐磨損性及耐彎曲性等機(jī)械性能[4]，被廣泛應(yīng)用于纖維加工、紙加工、薄膜等制造工業(yè)[5]；PVA也可以與其他材料混合，形成復(fù)合材料。孫復(fù)錢等[6]采用靜電紡絲技術(shù)制備聚乙烯醇/二氧化鈦復(fù)合納米纖維膜，這種材料具有良好的光催化性能，有望在環(huán)境污染治理、污水處理等領(lǐng)域得到應(yīng)用。PVA還具有良好的生物相容性和生物可降解性，近年來相繼開發(fā)了聚乙烯醇水溶液在眼科[7]、傷口敷料[8]和人工關(guān)節(jié)[9]等方面的應(yīng)用，聚乙烯醇薄膜在藥用膜，人工腎膜[10]、血管移植[11]等方面的應(yīng)用；聚乙烯醇微球在藥物緩釋[12]方面的應(yīng)用。

以往研究中，作為PVA的交聯(lián)劑通常為醛類[13]，也有的會使用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)[14]做為交聯(lián)劑，但都有一定的毒性。三偏磷酸鈉(STMP)是一種對人體無毒的鈉鹽，為白色結(jié)晶或白色粉末，易溶于水，在食品工業(yè)中用作淀粉改性劑、果汁飲料防混劑、肉制品保水、黏合劑、分散劑、穩(wěn)定劑等[15]。本文以三偏磷酸鈉為交聯(lián)劑，與以往常用的交聯(lián)劑(如甲醛，戊二醛，環(huán)氧氯丙烷等)相比，會使交聯(lián)得到的微球具有更好的生物相容性。而采用反相懸浮的方法制備聚乙烯醇微球，則可以得到粒徑分布均勻，球型較佳的微球，這為之后將聚乙烯醇微球作為一種安全的體內(nèi)植、介入材料，成為一種藥物緩釋載體提供了基礎(chǔ)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 主要儀器與試劑

以聚乙烯醇(PVA 124，化學(xué)純)為原料，三偏磷酸鈉(STMP，化學(xué)純)為交聯(lián)劑，液體石蠟(化學(xué)純)和失水山梨醇單油酸酯(span-80，化學(xué)純)為油相，氫氧化鈉(分析純)為催化劑來制備聚乙烯醇微球。在制備過程中，向樣品加入無水乙醇(分析純)和異丙醇(分析純)進(jìn)行離心處理。

在實(shí)驗(yàn)過程中，需要用到的儀器有：電子天平(JA2003)，酸度計(jì)(PHS-25)，鼓風(fēng)干燥箱(CT-C)，離心機(jī)(YXJ-B)，恒溫?cái)?shù)顯磁力攪拌器(WYP 11-2)。制備微球后，利用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet Nexus 670)和核磁共振波譜儀(AVANCE Ⅲ)分析交聯(lián)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；通過掃描電子顯微鏡(S-48000)以及生物顯微鏡觀察微球的表面形貌，并分析微球的粒徑分布和平均粒徑大小；利用表面接觸角測量儀(Easy Drop FM40)測量微球的表面接觸角，分析微球的親水性。

2.2 聚乙烯醇微球的制備

在攪拌條件下，向40mL液體石蠟中加入2.0g表面活化劑Span-80，構(gòu)成連續(xù)油相；攪拌一段時(shí)間后，向油相中加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的PVA，充分混合后，加入2.0g STMP作為交聯(lián)劑，最后加入1mL NaOH作為催化劑。設(shè)置轉(zhuǎn)速為400r/min，在50℃反應(yīng) 16h。

交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，靜置30min。加入少量的無水乙醇，放入離心機(jī)中進(jìn)行離心分離，取出上清液，將沉淀物反復(fù)用無水乙醇，異丙醇以及純水洗滌，最后放入鼓風(fēng)干燥箱中干燥24h，得到白色粉末。

2.3 測試與表征

將PVA原料和干燥后的PVA微球分別與溴化鉀混合研磨、壓片后在3900～600cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描測試。比較反應(yīng)前后的特征峰，分析產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，確定交聯(lián)產(chǎn)物的生成。

采用AVANCE Ⅲ 300MHz 固體核磁共振波譜儀測定產(chǎn)品波譜，并用高功率質(zhì)子去耦31P NMR光譜分析樣品。該儀器1H的共振頻率為300.16MHz，31P的共振頻率為121.50MHz，樣品粉末放入直徑為5mm的Zro轉(zhuǎn)子中，轉(zhuǎn)速為8kHz。P的化學(xué)位移以85%的磷酸作為參考。所有的循環(huán)延遲時(shí)間為5s，掃描1024次。

取一定量未經(jīng)篩分的微球，置于掃描電鏡下，觀測微球的表面形貌以及計(jì)算微球的平均粒徑。

Dn=Σnidi/Σni

(1)

其中，Dn為平均粒徑，di為微球的直徑，ni為該粒徑微球的數(shù)目。

采用座滴法測量微球接觸角，使用去離子水作為液體樣品。取一定量聚乙烯醇微球，壓片，放入樣品臺上，調(diào)整樣品臺高度，讓聚乙烯醇壓片能夠承接擠出的液滴，并能在其表面形成液滴。記錄此時(shí)的接觸角大小，并多次測量，取平均值。

精密稱取PVA微球50mg(W1)，將其浸泡于0.9%的生理鹽水中，分別在浸泡15，30，45，60，75及90min時(shí)取出微球，擦干微球表面的水分進(jìn)行稱重(W2)。按式(2)計(jì)算溶脹率，并繪制溶脹率與時(shí)間的關(guān)系曲線：

(2)

取50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的Nacl溶液，向其中加入50mg PVA微球粉末，超聲振蕩將微球打散；將pH計(jì)插入到配置好的溶液中，用磁力攪拌器慢速攪拌；一邊攪拌一邊向其中加入濃度為0.1mol/L的HCl準(zhǔn)溶液，使得溶液的pH值為4；最后向混合溶液中滴加濃度為0.01mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行反滴定，滴定到pH值為9，而且保持5min不變時(shí)方可視為滴定終點(diǎn)。并用式(3)計(jì)算微球表面所含羥基的數(shù)量：

(3)

其中，N為羥基的數(shù)量，V為所用NaOH的體積(單位為ml)，M為PVA的質(zhì)量，即0.05g。

3 結(jié)果與討論

3.1 PVA的反應(yīng)機(jī)理

STMP作為交聯(lián)劑，在堿性的條件下，易與聚合物中的-OH基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)酯化反應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)[13]推測，其反應(yīng)如Scheme 1所示。

PVA和STMP在堿性條件下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)方程(a) 醇化物的形成； (b) STMP在堿性條件下的分解； (c) STMP的開環(huán)； (d) 單磷酸酯的形成； (e) 焦磷酸鈉的形成。Scheme 1 STMP reaction with poly(vinyl alcohol)(ROH) in alkaline medium. Alcoholate formation(a), alkaline degradation of STMP(b), STMP opening (c), monophosphate crosslinking formation (d) and pyrophosphate crosslink formation(e)

3.2 紅外譜圖分析

由于PVA中含有大量的-OH，會與STMP發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生交聯(lián)，生成磷酸酯類產(chǎn)物。對照PVA和交聯(lián)之后的PVA譜圖可以發(fā)現(xiàn)(見圖1)，交聯(lián)之后的PVA在3200～3500cm-1范圍內(nèi)的羥基峰有所變化，說明STAM與PVA中的羥基發(fā)生了反應(yīng)。在2937cm-1處的吸收峰為主鏈亞甲基(-CH2-)的不對稱伸縮振動峰。該峰在交聯(lián)之后的PVA中變得圓滑，且峰的強(qiáng)度有所降低。在1165cm-1處，出現(xiàn)了新的吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)[15]，可把其歸結(jié)為P=O的振動峰。在1095cm-1處為C-O的吸收峰，對比兩圖可發(fā)現(xiàn)，此處的吸收峰強(qiáng)度變強(qiáng)，是原料和三偏磷酸鈉交聯(lián)之后生成P-O-C基團(tuán)造成的[16]。

圖1 紅外圖譜(1是PVA，2是STMP交聯(lián)之后的PVA)Fig.1 FT-IR spectra of PVA without (1) and with crosslinking by STMP (2)

圖2 31P核磁譜圖(樣品1:STMP；樣品2：PVA；樣品3：PVA和STMP的物理混合；樣品4：PVA和STMP的化學(xué)交聯(lián))Fig.2 Nuclear Magnetic Resonance spectra(Sample 1:STMP; Sample 2:PVA; Sample 3: the physical blending of PVA and STMP; Sample 4: the chemical crosslinking of PVA and STMP)

3.3 核磁波譜分析

圖2中，由Sample 2譜可知，PVA中不存在P元素；對比Sample 1和Sample 3譜可以發(fā)現(xiàn)，PVA和STMP物理混合的譜和STMP原料的譜相同，說明物理混合后，沒有新產(chǎn)物生成；根據(jù)文獻(xiàn)[17]可知，在-19.05ppm處為STMP的特征峰，代表P=O；除此以外在5.47ppm，-4.89ppm，-15.75ppm處出峰，這是由于在制備STMP過程中的副產(chǎn)物殘留，由文獻(xiàn)[18,19]可知，其分布對應(yīng)磷酸鈉、焦磷酸鈉、多聚磷酸鈉；將sample 4譜與Sample 1或Sample 3譜對比可以發(fā)現(xiàn)，sample 4譜在多處出現(xiàn)新的峰，根據(jù)Sang[20]等人對STMP與-OH發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)之后的產(chǎn)物的31P譜圖的分析可推斷得：-16.03ppm處對應(yīng)的產(chǎn)物為三磷酸單聚物(如：單聚乙烯醇三磷酸(MPTP))，-6.38ppm處推斷是單聚乙烯醇雙磷酸酯(MPDP)的特征峰,而2.72ppm處可歸屬于單聚乙烯醇單磷酸酯(MPMP)和雙聚乙烯醇單磷酸酯(DPMP)。從sample 4中還可以發(fā)現(xiàn)在-19.3ppm處仍然存在著P=O的特征峰，以及-18.30ppm處對應(yīng)的三聚磷酸鈉(STPP)的峰，這是因?yàn)镻VA的粘性比較大，故無法將產(chǎn)物中的雜質(zhì)完全清除所致[21]。從反應(yīng)前后的譜圖的差異可以看出：PVA與STMP之間發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。

3.4 掃描電鏡分析

從圖3可見，微球的表面形貌良好，粒徑較均勻。根據(jù)SEM照片中微球的數(shù)目，以及每個(gè)粒徑范圍內(nèi)微球的數(shù)量，繪制出圖4所示的粒徑分布圖。

圖3 PVA微球的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM image of PVA microspheres

圖4 PVA微球的粒徑分布圖Fig.4 Image of particle size distribution of PVA microspheres

綜合所有的微球SEM照片可知，微球的粒徑大致分布在1～20μm之間，根據(jù)公式計(jì)算得出微球的平均粒徑為11.5μm。

載藥微球系藥物與高分子材料制成的球形或類球形實(shí)體，通常粒徑范圍為1 ～ 250μm。藥物微球相較于一般的給藥系統(tǒng)，具有更好的靶向性。目前，藥物微球的給藥途徑有注射給藥、口服給藥、肺部給藥和鼻腔給藥等，而微球粒徑的大小就影響著給藥途徑。本文的PVA微球的粒徑可滿足藥物載體對微球粒徑的要求。而由文獻(xiàn)[22]可知，PVA水溶液的濃度、PVA與STMP的比例，交聯(lián)時(shí)間、轉(zhuǎn)速、催化劑的用量等都會影響微球的粒徑分布。

3.5 接觸角測定

接觸角是表征液體在固體表面潤濕性的重要參數(shù)之一，其可以反映液體在一定固體表面的潤濕程度。若θ<90°，則固體表面是親水性的，即液體較易潤濕固體，其角越小，表示潤濕性越好；若θ>90°，則固體表面是疏水性的，即液體不容易潤濕固體，容易在表面上移動。

由于PVA微球表面含有大量羥基，所以具有很好的親水性，以致于液體樣品不能在PVA微球表面形成液滴，而是在非常短的時(shí)間(1s)內(nèi)浸入到壓片中，如圖5所示。

3.6 溶脹率分析

分別在0～90min時(shí)取7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每隔15min從生理鹽水中取出PVA微球，擦干表面水分后稱重，計(jì)算微球的溶脹率，并繪制出溶脹率與時(shí)間的關(guān)系曲線，如圖6所示。

從圖可見，干燥微球在0～15min內(nèi)快速膨脹，15～30min內(nèi)溶脹速率逐漸降低，至30min時(shí)達(dá)到飽和狀態(tài)，微球的飽和溶脹率為119.6%。

微球作為藥物載體進(jìn)入體內(nèi)后，在體液的作用下膨脹。膨脹的過程中，會使得微球表面的孔隙增大，以達(dá)到釋放藥物的效果。本文制備的PVA微球在生理鹽水中30min后到達(dá)飽和，飽和溶脹率為119.6%，這為PVA微球作為載藥釋藥系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

3.7 微球表面所含羥基數(shù)量

按照第2.3節(jié)中的實(shí)驗(yàn)步驟，最終所使用的0.01 mol/L NaOH溶液的體積為0.15mL，按式(3)計(jì)算微球表面所帶羥基的數(shù)量為：

圖5 PVA微球接觸角 (a) t=0.2s; (b) t=0.4s; (c) t=0.6s; (d) t=0.8s; (e) t=0.9s; (f) t=1.0sFig.5 Contact angle (a) t=0.2s; (b) t=0.4s; (c) t=0.6s; (d) t=0.8s; (e) t=0.9s; (f) t=1.0s

圖6 PVA微球的溶脹曲線和溶脹率Fig.6 Curve of the relation of time and the swelling rate

4 結(jié) 論

本文用一種無毒的、生物相容性更佳的STMP作為交聯(lián)劑，采用反相懸浮—化學(xué)交聯(lián)的方法，制備PVA微球。

通過FTIR和NMR對交聯(lián)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) STMP可以與PVA中的-OH發(fā)生酯化反應(yīng)，驗(yàn)證了STMP的確與PVA發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，并推測出了PVA與STMP的反應(yīng)機(jī)理：一分子STMP可以與兩分子PVA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，交聯(lián)過程分為兩步，第一步生成三聚磷酸鈉(STPP)和單聚乙烯醇三磷酸酯(STPPg)；第二步生成了雙聚乙烯醇單磷酸酯(Pc)和焦磷酸鈉(PPi)以及雙聚乙烯醇雙磷酸酯(PPc)和磷酸鈉(Pi)。

利用SEM觀察到交聯(lián)之后的微球球型良好，微球的粒徑大致分布在1～20μm之間，根據(jù)公式計(jì)算得出微球的平均粒徑為11.5μm。

由接觸角的測定分析說明制備得到的交聯(lián)PVA微球保留有良好的親水性，而生物材料的親水性會影響到細(xì)胞在材料表面的吸附以及基因表達(dá)，以此影響著生物材料的生物相容性[23]。

由公式測得微球在生理鹽水中的飽和溶脹率為119.6%。PVA微球的這些性能為之后應(yīng)用于載藥釋藥系統(tǒng)研究提供了理論依據(jù)。