羅飛亞，馮克然，張露勇，胡培麗，邢書霞，王鋼力

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

皮膚腐蝕性是化學品及化妝品安全管理中一項較為重要的毒理學終點，隨著動物福利“3R”(減少Reduction、優(yōu)化Refinement、替代Replacement)原則的提出，在毒理學安全性評價領域中，替代檢測技術受到越來越多的關注[1-3]。OECD指南批準的皮膚腐蝕性替代試驗僅有3類，包括大鼠經(jīng)皮電阻試驗(transcutaneous electrical resistance test method，TER)[4]，體外皮膚刺激性/腐蝕性的重組人表皮模型試驗(RHE)[5-6]和體外皮膚腐蝕性膜屏障試驗[7]。其中TER是利用大鼠背部離體皮膚檢測腐蝕性，與傳統(tǒng)的家兔試驗相比[8]，TER減少動物數(shù)量、減輕動物痛苦，符合“3R”原則[9-10]。OECD指南中推薦使用Wistar大鼠或其他類似品系的大鼠，考慮SD大鼠是較為常用的研究皮膚病理相關的大鼠品系[11-12]，而SD大鼠又是由Wistar大鼠育種而來，但兩種品系已存在遺傳學差異[13]。因此，本研究通過對比SD大鼠與Wistar大鼠的經(jīng)皮電阻腐蝕性測試結果，從而為大鼠經(jīng)皮電阻測試選擇合適的大鼠品系提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar種大鼠，鼠齡18～21 d，體重60～80 g；SPF級SD大鼠，鼠齡18～21 d，體重80～100 g，均由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心提供【SCXK(京)2014-0013】。動物試驗環(huán)境條件為屏障環(huán)境【SYXK(京)2016-0004】，溫度22℃～24℃，相對濕度50%～70%，動物自由飲食，日光燈12 h照明。大鼠皮膚應健康無破損，試驗前動物在實驗動物房環(huán)境中至少適應3 d后，剃去背部和兩側被毛，間隔3 d以含抗生素溶液浸洗去毛區(qū)2次。

1.2 試劑與儀器

選擇《化妝品安全技術規(guī)范》(2015版)大鼠經(jīng)皮電阻試驗中推薦的12種參考物質作為受試物：4-氨基-1,2,4-三氮唑(TCI)、丁子香酚(國藥集團北京分公司)、溴乙基苯(Alorich)、四氯乙烯(國藥集團北京分公司)、異硬脂酸(Adamas)、4-甲硫基-苯甲醛(TIC)、N,N-二甲基亞二丙基三胺(Adamas)、鄰叔丁基苯酚(TCI)、氫氧化鉀(10% w/v，國藥集團北京分公司)、硫酸(10% w/v，國藥集團北京分公司)、辛酸(國藥集團北京分公司)、1,2-丙二胺(國藥集團北京分公司)。以鹽酸(10 mol/L)作為陽性對照，去離子水作為陰性對照。電解液(154 nmol/L MgSO4)、羅丹明B染料(10% w/v SRB)、染料萃取液(30% w/v SDS)。

大鼠經(jīng)皮電阻儀由北京華清天禧醫(yī)藥科技有限公司提供，儀器參數(shù)符合OECD指南及《化妝品安全技術規(guī)范》(2015版)[12]要求(工作電壓220 V，50 Hz，交流電，工作電極為2根216惰性銀電極)，皮膚固定裝置選用聚四氟乙烯參照OECD指南裝置示意圖及尺寸要求制作[5,14]。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠經(jīng)皮電阻儀24 h穩(wěn)定性

分別選取同一只Wistar大鼠或SD大鼠(29 d)背部靠近脊柱兩側的皮膚，制成直徑約20 mm的小皮片5～6塊，連續(xù)觀察24 h內分別選取不同時間點(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、20、22、23和24 h)，讀取大鼠經(jīng)皮電阻值(TER)，重復試驗3次，統(tǒng)計結果。

1.3.2 大鼠經(jīng)皮電阻試驗

依照《化妝品安全技術規(guī)范》(2015版)[14]的描述(與OECD指南操作一致)，大鼠于第29天時處死(大鼠處死時間必須在第28～30天內)，剪取去毛區(qū)皮膚，剔除皮下脂肪，表皮面向上固定于聚四氟乙烯管上，剪去多余皮膚，以液體石蠟封口。試驗前向管內加入1 mL電解液(154 mmol/L硫酸鎂溶液)，接上電極測定TER值，大于20 kΩ者可用。

液體受試物原液150 μL直接加入管內皮片的表皮面；固體受試物先研磨成細粉，取約100 mg撒在皮片表面，再加150 μL去離子水潤濕以增加受試物與表皮的接觸。加樣后室溫靜置24 h，以流水輕柔地沖洗皮片表皮面，用洗瓶向表皮面滴加足量70%的乙醇，5 s后去除乙醇，再以流水清洗。盡量除凈受試物后，向管內加入1 mL電解液，接上電極測定TER值。記錄TER值后，去除管中的電解液，肉眼檢查并紀錄皮片的損傷情況。

1.3.3 羅丹明B(SRB)染料滲透量測定

向管內皮片表皮面滴加150 μL羅丹明B染料(10% SRB水溶液)，室溫靜置2 h，以流水輕柔的沖洗管壁，去除多余的SRB，并將皮片取下，放入含8 mL雙蒸水的離心管中震搖5 min，換干凈的雙蒸水重復清洗1次。將皮片放入5 mL萃取液(30% SDS水溶液)中，60℃水浴提取過夜，去除皮片，剩余提取液以1900 r/min離心8 min，取上清液1 mL加4 mL萃取液稀釋至5 mL，測吸光度值(OD值為565 nm)。

1.3.4 結果判定標準方案

OECD判定程序[4]：按OECD TG430的判定程序，TER>5 kΩ為非腐蝕性(NC)；對于TER≤5 kΩ且肉眼觀察皮片有明顯損傷判為腐蝕性(C)；TER≤5 kΩ且肉眼觀察皮片沒有明顯損傷的進行染料滲透量測定；染料滲透量大于或等于10 mol/L鹽酸的為C，染料滲透量小于10 mol/L鹽酸的為NC。

注：E1-3分別為3次24 h穩(wěn)定性監(jiān)測曲線。

《化妝品安全技術規(guī)范》[14]判定程序：TER>15 kΩ為NC，TER<5 kΩ且肉眼觀察皮片有明顯損傷判定為C；TER為5 ～15 kΩ且肉眼觀察皮片未見明顯損傷的，或3個平行樣的TER值在界值(5、15 kΩ)上下波動的或肉眼可見皮片明顯破損、變色、變硬等可疑情況，需進行染料滲透量測定，染料滲透量大于或等于10 mol/L鹽酸的為C，染料滲透量小于10 mol/L鹽酸的為NC。

為同時兼顧OECD和《化妝品安全技術規(guī)范》的判定程序，實際上在試驗中，除TER>15 kΩ，且肉眼觀察皮片無損傷的受試物組外，其余組別的皮片均進行了羅丹明B染色的步驟。

2 結果

2.1 大鼠經(jīng)皮電阻儀24 h儀器穩(wěn)定性結果

大鼠皮片TER值變化如圖1所示，在皮片置于皮膚固定裝置后，TER值呈降低趨勢，24 h后穩(wěn)定在20～30 kΩ。兩種大鼠皮片TER值3次重復試驗的變化趨勢一致。

2.2 TER腐蝕性結果判定及真實性分析

采用TER方法對12種參考物質進行腐蝕性檢測，綜合考慮TER值、羅丹明B染料滲透量和肉眼觀察皮片損傷結果，并分別用OECD指南[4]和我國《化妝品安全技術規(guī)范》[14]的判定標準進行判定，結果如表1和表2所示。Wistar和SD大鼠檢測陰性對照(雙蒸水)TER平均值分別為18.36 kΩ和24.35 kΩ，符合OECD指南和安全技術規(guī)范中的參考數(shù)據(jù)(10～25 kΩ)，陽性對照10 mol/L鹽酸的TER平均值分別3.93 kΩ和3.81 kΩ，均略高于OECD指南和安全技術規(guī)范的參考數(shù)據(jù)(0.5～1.0 kΩ)。

以OECD指南判定標準的結果顯示，N,N-二甲基亞二丙基三胺、10%氫氧化鉀和辛酸在Wistar和SD大鼠的檢測結果中均呈現(xiàn)假陰性；以《化妝品安全技術規(guī)范》的判定標準結果顯示，4-甲硫基-苯甲醛以Wistar大鼠檢測結果呈現(xiàn)假陽性，以SD大鼠檢測結果呈現(xiàn)陰性。

2.3 兩品系大鼠結果比較

將兩品系大鼠用兩種方案判定的結果進行方法真實性分析，并與這12種參考物質的實際皮膚腐蝕性數(shù)據(jù)[15]進行χ2檢驗對比(表3)，發(fā)現(xiàn)兩品系大鼠使用OECD指南判定腐蝕性結果一致，靈敏性50%，特異性100%；兩品系大鼠使用安全技術規(guī)范判定的結果中，以SD大鼠效能最高，特異性和敏感性均達到100%，Wistar大鼠靈敏性100%，特異性83.3%。兩品系大鼠使用OECD指南和《化妝品安全技術規(guī)范》判定結果均無顯著性差異(P>0.05)。

兩品系大鼠對同一個物質腐蝕性判定的結果基本一致，除Wistar大鼠以安全技術規(guī)范方法判定4-甲硫基-苯甲醛為腐蝕性(假陽性)而SD大鼠判定為非腐蝕性外，其余物質的判定結論均一致。經(jīng)對比，兩品系大鼠采用同一種判定標準判定的腐蝕性結果沒有顯著的統(tǒng)計學差異(P>0.05)。實驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠的TER讀數(shù)整體偏低，皮片初始的電阻值偏小，棄用的情況較多。綜上，在本實驗條件下，推薦使用SD大鼠進行經(jīng)皮電阻試驗。

表1 Wistar大鼠腐蝕性測試結果

注：1：C：腐蝕性；NC：非腐蝕性；各受試物經(jīng)皮腐蝕性為UN GHS目錄中基于體內數(shù)據(jù)判定的結果[15]。2：No：未觀察到皮片損傷；Yes：觀察到皮片損傷。Note.1:C: Corrosion; NC: None corrosion; the corrosion were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults[15].2: No：There is no obvious damage on skin disc; Yes：There is obvious damage on skin disc。

表2 SD大鼠腐蝕性測試結果

注：1：C：腐蝕性；NC：非腐蝕性；各受試物經(jīng)皮腐蝕性為UN GHS目錄中基于體內數(shù)據(jù)判定的結果[15]。2：No：未觀察到皮片損傷；Yes：觀察到皮片損傷。Note.1:C: Corrosion; NC: None corrosion; the corrosion were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults[15].2: No: There is no obvious damage on skin disc;Yes: There is obvious damage on skin disc。

表3 兩品系大鼠經(jīng)皮電阻試驗結果各判定方案的真實性指標分析(n=6，%)

注*: 所有結果與各受試物參考腐蝕性數(shù)據(jù)[15]進行比對。

Note.*. All results compared with the reference corrosive parameters of the tested substance.

3 討論

OECD指南[4]和《化妝品安全技術規(guī)范》[14]方法中對試驗是否進行第二步羅丹明B染色步驟的要求略有不同：OECD是以5 kΩ為界值，只要檢測獲得的TER值大于5 kΩ，且肉眼觀察皮片無損傷，則不需要經(jīng)過染色直接判定為非腐蝕性；而安全技術規(guī)范中要求在TER值為5 ～15 kΩ且肉眼觀察皮片未見明顯損傷的，或3個平行樣的TER值在界值(5、15 kΩ)上下波動的或肉眼可見皮片明顯破損、變色、變硬等可疑情況，均需進行染色步驟的判定。本研究中，兩品系大鼠均表現(xiàn)為使用化妝品安全技術規(guī)范判定時方法效能更高，說明進行羅丹明B染色可有效地提高對皮膚腐蝕性判定的準確性。

TER方法腐蝕性判定界值與研究所使用的大鼠經(jīng)皮電阻儀性能相關[16]，不同的大鼠經(jīng)皮電阻儀其判定界值可能會改變，這點與OECD指南[4]中指出的“如采用新的儀器檢測，可能會改變判定界值，需要進一步驗證”的描述一致。本研究中所使用的大鼠經(jīng)皮電阻儀是配合《化妝品安全技術規(guī)范》方案設計，因此使用安全技術規(guī)范的方案判定效能更高。

OECD指南及《化妝品安全技術規(guī)范》中均推薦使用Wistar大鼠，但原文中也說可以使用其他類似品系的大鼠。SD大鼠自1925年由Wistar大鼠培育而成[13]，廣泛應用于皮膚腫瘤、皮膚科藥物、皮膚病理等方面的研究，結合本研究的數(shù)據(jù)認為，SD大鼠可代替Wistar大鼠進行TER檢測，符合OECD指南及《化妝品安全技術規(guī)范》對動物品系的要求。