李香 劉文俊 曲春曉 易凡

250012 濟南，山東大學醫(yī)學院(李香、易凡)； 250013 濟南，山東省胸科醫(yī)院藥劑科(劉文俊、曲春曉)

炎癥反應是心肌梗死(myocardial infarction，MI)發(fā)生、發(fā)展的重要機制。雖然MI的發(fā)病機制復雜，但臨床試驗和動物研究發(fā)現(xiàn)，內源性免疫系統(tǒng)激活誘導的炎癥反應是MI的主要病理生理過程[1-2]。固有免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(PRRs)識別病原相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)，誘導多種炎性介質和生長因子的釋放，促使炎性細胞募集、血管生成、成纖維細胞增殖，導致疤痕形成和梗死愈合[3-4]。N樣受體(NLRs)是模式識別受體家族中主要的受體，在NLRs家族中，共有22個成員，其中最具代表性的是核苷酸結合寡聚化結構域2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2，NOD2)。研究發(fā)現(xiàn)，NOD2基因的變異與克羅恩病(Crohn，s disease，CD)和Blau綜合征(Blau syndrome，BS)有關[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，NOD2與動脈粥樣硬化、老年癡呆和糖尿病等多種疾病的發(fā)病機制有關[6-9]。盡管Shigeoka等[10]第一次提出NOD2在腎缺血再灌注損傷中的作用，但到目前為止，未見NOD2在MI發(fā)病機制方面的相關報道。因此，本文探討NOD2在永久結扎冠狀動脈左前降支造成MI模型中的作用和相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8～10周齡的雄性C57BL/6野生小鼠、NOD2基因敲除小鼠各40只，體重25～30 g，隨機分為四組：野生/假手術組(WT/Sham組)和NOD2基因敲除/假手術組(NOD2-/-/Sham組)各15只，野生/心肌梗死組(WT/MI組)和NOD2基因敲除/心肌梗死組(NOD2-/-/MI組)各25只。通過永久結扎冠狀動脈左前降支制造心肌梗死模型，假手術組僅穿線不結扎。

1.2 超聲心動圖

小鼠經(jīng)1.5%異氟烷吸入麻醉后用Philips 7500小動物超聲系統(tǒng)進行經(jīng)胸超聲心動圖檢查，探頭采樣頻率為12 MHz。圖像由M型、二維、脈沖波(PW)多普勒和聲學密度獲得。

1.3 炎性因子檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定心肌組織中的細胞趨化因子和細胞因子。

1.4 RNA提取和RT-PCR

Trizol法抽提心肌總RNA，real-time RT-PCR檢測假手術、梗死區(qū)心肌、非梗死區(qū)心肌NOD2的mRNA水平。NOD2 的上游引物是5’-CCTGGTACGTGCCCAAAGTAG-3’，下游引物是5’-GCCAAGTAGAAAGCGCAAA-3’。

1.5 免疫印跡分析

采用免疫印跡法測定NOD2、MMP-9在心肌組織中的表達。NOD2抗體購自美國Protein Tech Group，MMP-9抗體購自美國Abcam。

1.6 免疫組化法

采用免疫組化法檢測心肌組織梗死區(qū)域NOD2、CD68、α-SMA的表達。

1.7 明膠酶譜法

采用明膠酶譜法測定MMP-9的活性。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 NOD2在MI區(qū)域表達顯著提高

在MI的0、3、7、14和28 d分別收集梗死區(qū)和非梗死區(qū)的心肌組織，通過qPCR檢測NOD2 mRNA表達。如圖1A，與WT/Sham組相比，WT/MI組非梗死區(qū)和梗死區(qū)NOD2 mRNA表達水平明顯升高(均為P<0.05)，其中梗死區(qū)NOD2的mRNA表達變化水平最高，且呈時效性變化，在MI第7天達到頂峰，28 d后回落，但與WT/Sham組比較仍有顯著性差異(均為P<0.05)。取MI 28 d的梗死組織測NOD2蛋白濃度，與WT/Sham組相比，WT/MI組的NOD2濃度顯著升高(圖1B)；免疫組化結果也證實MI 28 d后，NOD2表達仍增強(P<0.05)(圖2)。

2.2 NOD2缺失能減弱MI后心臟功能失常和心肌重構的發(fā)生

在MI 28 d后通過超聲心動圖評價心臟功能。與WT/Sham組相比，WT/MI組EF、FS顯著降低(均為P<0.05)；而NOD2-/-/MI組EF、FS減弱程度降低。同時，MI后左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑及左室舒張末期容積增大(均為P<0.05)，表明左室肥大；WT/MI組MI后左室舒張末期室間隔厚度和左室收縮末期室間隔厚度降低(均為P<0.05)，表明左室壁變薄。而NOD2-/-/MI組左室肥大和室壁變薄現(xiàn)象減輕，心室重構現(xiàn)象減弱(表1)。

同時，Tunel染色顯示MI 28 d梗死區(qū)心肌細胞凋亡較假手術組增加，但NOD2-/-/MI組細胞凋亡明顯降低(P<0.05)(圖3)。Masson染色提示，NOD2-/-/MI 組心肌纖維化程度遠低于WT/MI組(P<0.05)(圖4)。

與WT/Sham組相比，aP<0.05 ；與WT/MI組非梗死區(qū)相比，bP<0.05圖1 NOD2在梗死區(qū)和非梗死區(qū)心肌組織中的mRNA水平(A)和蛋白表達水平(B)

項目WT/Sham組(15只)NOD2-/-/Sham組(15只)WT/MI組(25只)NOD2-/-/MI組(25只)LVIDd(mm)2.79±0.572.82±0.383.56±0.40a3.23±0.47aIVSd(mm)0.71±0.100.75±0.110.43±0.17a0.58±0.19abIVSs(mm)0.97±0.071.01±0.120.65±0.12a0.77±0.17abLVPWd(mm)0.84±0.170.93±0.260.80±0.320.89±0.11LVPWs(mm)1.08±0.221.11±0.291. 05±0.381.14±0.13LVVd(μl)32.97±5.2230.39±6.7265.87±5.32a51.22±7.12abLVVs(μl)10.95±3.6312.04±2.6727.65±7.51a26.64±5.91aFS(%)34.92±5.6133.89±4.2925.11±3.97a28.22±2.90aEF(%)66.37±4.7765.22±6.1341.02±5.17a49.06±6.22ab

注：LVIDd： 舒張期左室內徑； LVIDs： 收縮期左室內徑； IVSd： 舒張期室間隔厚度； IVSs： 收縮期室間隔厚度； LVPWd： 舒張期左室后壁厚度； LVPWs： 收縮期左室后壁厚度； LVVd： 左室舒張末期體積； LVVs， 左室收縮末期體積； FS： 縮短分數(shù)； EF： 射血分數(shù)。與WT/Sham組相比，aP<0.05 ；與WT/MI組相比，bP<0.05

圖2 NOD2在梗死區(qū)心肌組織中的蛋白表達

圖3 Tunel染色表明NOD2缺失保護缺血誘導的細胞凋亡

圖4 Masson染色顯示NOD2缺失降低纖維化水平

2.3 NOD2缺失能降低MI炎性因子水平、炎性細胞浸潤和MMP-9活性

MI初期，大量心肌細胞死亡引發(fā)了急性炎癥反應，進而引起化學趨化因子和細胞因子的激活。MI后，IL-1β、TNF-α、TGF-β和MCP-1等炎性因子水平顯著升高(均為P<0.05)，而NOD2缺失降低了這些炎性因子的水平(圖5A)。小鼠MI后MMP-9的蛋白和活性升高，NOD2缺失后減弱了MI導致的MMP-9蛋白和活性水平的提高(均為P<0.05)(圖5B)。

與WT/Sham組相比，aP<0.05 ；與WT/MI組相比，bP<0.05圖5 不同組別心肌組織的炎性因子水平(A)和MMP-9蛋白表達水平(B)

α-SMA是心肌成纖維細胞的特征標志物。α-SMA在心肌非梗死區(qū)域表達較少，而在梗死區(qū)域大量分布；NOD2缺失后α-SMA在梗死區(qū)域的分布減弱。因此，MI引起的炎性細胞浸潤(CD68)在NOD2-/-鼠中顯著降低(P<0.05)(圖6)。

圖6 WT及NOD2-/-心肌梗死區(qū)CD68和α-SMA染色

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)NOD2在梗死的心肌組織中表達上調，NOD2缺失能顯著減弱MI導致的心室重構。進一步研究表明，NOD2通過調控MMP-9的表達和活性以及炎性因子水平介導MI后左室重構。

內源性免疫系統(tǒng)在炎癥疾病的發(fā)病中起重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)內源性免疫應答和心血管疾病之間的關系。TLRs的激活參與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括動脈粥樣硬化、敗血癥和充血性心力衰竭引起的心功能不全等。此外，NLRs在心血管疾病中也起重要的作用。NLR家族目前包含22個成員，分為兩大類，一類包含NOD1和NOD2等胞漿受體，介導MAPK和NF-κB信號通路；另一類包括NLRP1和NLRP3等胞內受體，介導炎癥體復合物的組裝，激活caspase-1、IL-1β和IL-18等炎性因子。NLRP3炎癥體不但參與動脈粥樣硬化，被膽固醇結晶激活，還介導心肌缺血再灌注損傷。研究證實，NOD1配體誘導特定部位的血管炎癥，調節(jié)心肌纖維化和心肌細胞凋亡[11]。Liu等[12]研究證明，NOD2通過調節(jié)心肌細胞凋亡和炎癥過程參與心肌缺血再灌注損傷。然而，關于NOD2在MI的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，通過降低炎癥水平及MMP-9表達和活性，NOD2在心梗組織中表達上調，NOD2-/-/MI組比WT/MI組心功能改善明顯、心室重構減弱、心肌纖維化程度降低和心肌細胞凋亡減少。

MMP-9是心臟重構的一個潛在的生物標志物[13]。動物MI模型中，MMP-9表達顯著增加，并與炎癥、細胞外基質降解和心臟功能不全等有關。臨床試驗也證實MMP-9和心室重構及死亡率之間的關系，因此MMP-9是診斷和(或)治療MI心室重構和充血性心力衰竭的生物標志物之一。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NOD2能增加MI模型MMP-9蛋白表達和活性。TLRs可介導MMPs的作用，例如MMP-9介導中性粒白細胞遷移到氣道、應答流感病毒誘導的TLR信號[14]；TLR4介導的信號誘導MMP-9依賴的B細胞表面CD23的斷裂[15]。但較少研究報道NOD2介導MMPs方面的作用。我們發(fā)現(xiàn)，在MI老鼠心肌組織中，MMP-9蛋白表達和活性顯著增強，而NOD2缺失后這種變化減弱。

NOD2缺失能降低MI導致的炎癥反應。MI初期，大量心肌細胞死亡引發(fā)了急性炎癥反應，激活化學趨化因子和細胞因子、趨化肥大細胞、中性粒細胞和單核細胞等炎性細胞到梗死組織，吸引巨噬細胞浸潤，促進炎癥反應。本研究中，MI后小鼠的巨噬細胞浸潤和IL-1β、TNF-α、TGF-β、MCP-1的表達均顯著增加，而NOD2缺失能顯著降低MI誘導的炎性因子表達及巨噬細胞浸潤。此外，肥大細胞可誘導成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞具有編碼膠原的基因且生成膠原能力較成纖維細胞顯著提高。本研究發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細胞在心肌梗死組織中大量表達，而NOD2-/-/MI組肌成纖維細胞的表達有所減少。

總之，本研究證實NOD2通過炎癥和MMP-9活性，參與心肌損傷信號轉導。NOD2在多個水平上介導的信號通路可成為治療心血管疾病的藥理學靶點。

利益沖突：無