王猛 王振亞 鄧潔琳 孟冠南 黃兵 余鋰鐳 江洪

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

心房顫動(dòng)是臨床最常見的快速性心律失常之一，而其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前研究表明，心外膜心房自主神經(jīng)節(jié)(ganglionated plexi，GP)是內(nèi)源性自主神經(jīng)的重要組成部分，在心房顫動(dòng)的觸發(fā)及維持中發(fā)揮著重要作用，心臟自主神經(jīng)節(jié)活性的增高可以誘發(fā)心房顫動(dòng)，而抑制其活性可以抑制心房顫動(dòng)的誘發(fā)及維持[1-3]。既往研究表明，炎癥在心房顫動(dòng)的觸發(fā)及維持中也發(fā)揮著重要作用，心房顫動(dòng)患者血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)和C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)等炎癥因子水平顯著升高[4-5]。TNF-α作為一種重要的促炎因子，在各種炎癥性疾病中均發(fā)揮著重要作用。然而，目前關(guān)于TNF-α與心房顫動(dòng)之間關(guān)系的潛在機(jī)制尚未明確。因此，筆者假設(shè)TNF-α可通過增強(qiáng)GP的活性參與心房顫動(dòng)的發(fā)生和維持，通過將微量TNF-α注入心房右前GP(anterior right ganglionated plexi，ARGP)中，來探討其對(duì)ARGP功能、對(duì)右心房和右肺靜脈心房顫動(dòng)閾值(atrial fibrillation threshold，AF-TH)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理

本研究經(jīng)武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(倫理號(hào)：04120A)，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供健康成年雄性家犬14只(體重15～18 kg)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將14只雄性家犬分為兩組：實(shí)驗(yàn)組(7只)及對(duì)照組(7只)；所有犬均以戊巴比妥鈉30 mg/kg體重經(jīng)靜脈進(jìn)行麻醉，術(shù)中每小時(shí)末以2 mg/kg體重維持麻醉狀態(tài)。開通股動(dòng)靜脈通道，股動(dòng)脈穿刺連接壓力換能器持續(xù)監(jiān)測(cè)血壓，股靜脈持續(xù)滴注生理鹽水補(bǔ)充丟失體液，氣管置管連接小型動(dòng)物呼吸機(jī)維持正壓通氣，持續(xù)記錄體表標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。

實(shí)驗(yàn)犬取左側(cè)臥位，經(jīng)右側(cè)第4肋間開胸，剪開心包，暴露心臟。將3根多極導(dǎo)管分別縫合于右上肺靜脈、右下肺靜脈和右心房等處用于起搏及記錄。所有信號(hào)均通過LEAD-7000多導(dǎo)電生理記錄儀系統(tǒng)(四川錦江電子公司)顯示。

1.2 TNF-α及生理鹽水注射

于右上肺靜脈和右心房連接處確認(rèn)脂肪墊中ARGP所在位置，分別將電極導(dǎo)管置于脂肪墊發(fā)放高頻刺激(high-frequency stimulation，HFS)(頻率20 Hz，脈寬0.1 ms，15 V)，引起心率減慢最顯著處即為ARGP所在位點(diǎn)。既往研究表明，經(jīng)靜脈注射8 μg/kg的TNF-α即可引起心房纖維化的發(fā)生，而將0.1 mg/ml的TNF-α注入下丘腦室旁核的神經(jīng)元可引起交感神經(jīng)的激活[6-7]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在直視狀態(tài)下將0.1 ml TNF-α(0.1 mg/ml)在1 min內(nèi)分4個(gè)不同位點(diǎn)緩慢注入實(shí)驗(yàn)組犬ARGP內(nèi)，而對(duì)照組注入等體積的生理鹽水。

1.3 ARGP功能測(cè)定

通過HFS刺激ARGP確定引起心率-電壓反應(yīng)最敏感的部位，將直徑0.1 mm的刺激電極一端插入ARGP，另一端連接刺激儀(Grass，美敦力，S88)，從5 V電壓起始進(jìn)行電壓遞增式HFS(20 Hz，0.1 ms)，刺激時(shí)間為10 s，間隔為30 s，刺激以5 V電壓間隔遞增，直至30 V電壓。進(jìn)行HFS時(shí)引起竇率減慢的最大值作為ARGP的功能指標(biāo)[8]。

1.4 ARGP神經(jīng)活性測(cè)定

通過HFS(20 Hz，0.1 ms)刺激ARGP引起心率減慢最明顯處為最佳記錄位點(diǎn)，將3個(gè)鍍鎢微電極用微型固定器并列固定，微電極尖端距離調(diào)整為2～3 mm，將尖端插入ARGP記錄神經(jīng)活性，另一端連接Powerlab生理記錄儀(8/35，AD Instrument，澳大利亞)。神經(jīng)活性信號(hào)定義為高于噪聲振幅3倍的記錄信號(hào)，信噪比大于3且穩(wěn)定后，在基礎(chǔ)狀態(tài)和注入TNF-α或生理鹽水30 min后持續(xù)記錄30 s的ARGP活性[9]。

1.5 AF-TH測(cè)定

以2倍起搏閾值電壓，起搏周長(zhǎng)為330 ms進(jìn)行心房起搏，在心房起搏后2 ms心房有效不應(yīng)期內(nèi)發(fā)放40 ms時(shí)長(zhǎng)的HFS(200 Hz，0.1 ms)，HFS電壓以1 V起始，1 V遞增HFS刺激，每次刺激持續(xù)20 s，一旦誘發(fā)快速觸發(fā)電位，HFS立即停止以便觀察能否誘發(fā)心房顫動(dòng)，各位點(diǎn)可誘發(fā)出心房顫動(dòng)的最低HFS電壓水平即定義為各位點(diǎn)的AF-TH[9-10]。心房顫動(dòng)定義為>500 次/min的不規(guī)則的心房激動(dòng)并伴隨不規(guī)則的方式傳導(dǎo)，持續(xù)時(shí)間>5 s。

表1 兩組不同刺激電壓下干預(yù)前后對(duì)最大心率減慢的影響

注：與基礎(chǔ)狀態(tài)比較，aP<0.01；與對(duì)照組比較，bP<0.01

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 在不同刺激強(qiáng)度下ARGP引起的最大心率變化百分比

與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，注入TNF-α 30 min后，HFS刺激ARGP引起的心率減慢最大改變百分比顯著增強(qiáng)。以15 V刺激電壓為例，實(shí)驗(yàn)組引起心率減慢的最大幅度由18.4%±5.5%增加至32.7%±6.8%(P<0.01)，而對(duì)照組引起心率減慢改變未見明顯變化(17.4%±5.3%比 16.8%±5.8%，P=0.08)，見表1。

2.2 TNF-α對(duì)ARGP神經(jīng)活性的影響

與基礎(chǔ)狀態(tài)比較，實(shí)驗(yàn)組干預(yù)30 min后ARGP的神經(jīng)放電頻率及振幅均顯著增加，而對(duì)照組無明顯改變，見表2。

2.3 TNF-α對(duì)心房各位點(diǎn)AF-TH的影響

與基礎(chǔ)狀態(tài)比較，實(shí)驗(yàn)組干預(yù)30 min后各位點(diǎn)的AF-TH顯著降低(均為P<0.05)，而對(duì)照組所有位點(diǎn)的AF-TH均無明顯變化(均為P>0.05)，見表3。

3 討論

自主神經(jīng)系統(tǒng)主要包括外源性和內(nèi)源性自主神經(jīng)系統(tǒng)，在心律失常的發(fā)生和維持中發(fā)揮著重要作用。Hou等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，GP是外源性和內(nèi)源性自主神經(jīng)系統(tǒng)的集成中心，增加其活性能降低心房的電生理穩(wěn)定性并增加心房顫動(dòng)的可誘導(dǎo)性。此外，我們團(tuán)隊(duì)在快速心房起搏的心房顫動(dòng)模型中發(fā)現(xiàn)，GP活性顯著增高并伴隨GP的電重構(gòu)和心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)相互促進(jìn)，在心房顫動(dòng)的誘發(fā)及維持中發(fā)揮著重要作用[12]?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，在心房顫動(dòng)的發(fā)生過程中，心房組織中TNF-α的表達(dá)量顯著增加，而TNF-α水平的增加可以導(dǎo)致心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)[13]，因此，TNF-α可能通過直接或間接影響GP的活性參與房顫的發(fā)生。

表2 兩組干預(yù)前后ARGP神經(jīng)活性的變化

注：與基礎(chǔ)狀態(tài)比較，aP<0.01；與對(duì)照組比較，bP<0.01

表3 兩組各位點(diǎn)AF-TH情況

注：與基礎(chǔ)狀態(tài)比較，aP<0.01；與對(duì)照組比較，bP<0.01

TNF-α被視為一種重要的內(nèi)生性炎癥調(diào)節(jié)因子，參與了細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞死亡等炎癥和免疫反應(yīng)過程，在各種免疫及炎癥性疾病中均發(fā)揮著重要的作用。在心臟中，TNF-α主要由心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等生成，是重要的促炎因子，可促進(jìn)IL-6、IL-1等炎癥因子的產(chǎn)生，并協(xié)同這些炎癥因子增加了心臟的炎癥狀態(tài)，影響心臟的收縮功能[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過引起心肌細(xì)胞離子通道和縫隙連接發(fā)生重構(gòu)導(dǎo)致心房發(fā)生電重構(gòu)，進(jìn)而引起動(dòng)作電位的傳播和鈣離子的傳遞異常[16]。Lee等[17]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TNF-α處理的肺靜脈心肌細(xì)胞出現(xiàn)了瞬時(shí)內(nèi)向電流增加、細(xì)胞內(nèi)外鈉-鈣交換電流增大、胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣含量減少等變化，致使舒張末期細(xì)胞內(nèi)鈣含量增加，這些改變表明TNF-α能夠增加肺靜脈的致心律失常活性并損傷心肌細(xì)胞的鈣調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥相關(guān)性心房顫動(dòng)的發(fā)生。此外，有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以使心房緊密連接蛋白40的表達(dá)量下降，從而增加心房顫動(dòng)的發(fā)生率[18]。而本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，將微量TNF-α注入ARGP后，ARGP的功能和活性顯著被激活，并降低了心房的AF-TH，提示TNF-α可能通過增強(qiáng)GP的活性參與了心房顫動(dòng)的發(fā)生和維持，這與我們的推測(cè)是相符合的。

目前，雖然肺靜脈隔離及GP消融可以治療心房顫動(dòng)，但仍存在心房顫動(dòng)復(fù)發(fā)、引發(fā)室性心律失常等不良反應(yīng)。因此，或許未來可以通過降低體內(nèi)TNF-α等炎癥因子水平延緩心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，進(jìn)而抑制心房顫動(dòng)的發(fā)生發(fā)展。在本研究中，我們通過向GP中局部注射TNF-α增加其炎癥狀態(tài)并觀察心房電生理特性的變化，而在正常生理狀態(tài)下TNF-α對(duì)GP活性的影響及病理狀態(tài)下通過何種途徑來增加GP活性的機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步通過慢性實(shí)驗(yàn)研究明確其潛在的神經(jīng)免疫機(jī)制。

利益沖突：無