王華杰 劉元敏 李光宇 吳志勇

摘 要 單個(gè)納米孔電流脈沖法是一種新型、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段，有望實(shí)現(xiàn)單分子核酸測(cè)序和生物傳感。由于通常條件下分子穿孔導(dǎo)致的電流脈沖時(shí)間短，電流水平低，對(duì)脈沖檢測(cè)系統(tǒng)提出了很高的要求。本研究基于自行組建的單個(gè)納米孔電流脈沖檢測(cè)系統(tǒng)，以單個(gè)α-溶血素（α-HL）納米孔為界面，探究了魚(yú)精蛋白在調(diào)控ssDNA電流脈沖中的作用。結(jié)果表明，此系統(tǒng)不僅能夠分別觀測(cè)帶正電的魚(yú)精蛋白和帶負(fù)電的ssDNA探針的電流脈沖信號(hào)，而且加入魚(yú)精蛋白，可使ssDNA電流脈沖的幅度及停留時(shí)間均顯著增加。本研究為基于分子相互作用提高電流脈沖的分辨能力提供了途徑。

關(guān)鍵詞 α-溶血素； 魚(yú)精蛋白； 單鏈DNA； 相互作用

1 引 言

蛋白質(zhì)可作為活化劑或抑制劑識(shí)別核酸不同堿基位點(diǎn)并與其結(jié)合，從而可以調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。通常研究蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的方法包括電泳遷移率法[1]、核酸酶足跡法[2]、蛋白結(jié)合微陣列法[3]、表面等離子共振法[4]、染色質(zhì)免疫沉淀法[5]等。此外還有單分子技術(shù)（SM），如原子力顯微鏡（AFM）[6]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移[7]、光鑷子[8]和磁鑷子[9]。當(dāng)生物分子穿過(guò)單個(gè)納米孔道時(shí)，可產(chǎn)生特征的電流脈沖信號(hào)，可用于單分子檢測(cè)[10]。該方法具有無(wú)需標(biāo)記、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在DNA測(cè)序方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。該方法還可用于分析多種目標(biāo)組分，如RNA[11]、多肽[12]、蛋白質(zhì)[13]、聚合物[14]、納米粒子[15]、金屬離子[16，17]等，以及在單分子水平上研究生物分子相互作用以及構(gòu)象變化[18]。DNA分子與其它分子通過(guò)相互作用形成復(fù)合物后，能夠產(chǎn)生特異性的電流脈沖信號(hào)[19]。如轉(zhuǎn)錄因子（RepE）與帶有前導(dǎo)寡鏈核苷酸的dsDNA作用形成復(fù)合物，進(jìn)入α-溶血素納米通道，產(chǎn)生與帶有前導(dǎo)寡鏈核苷酸的dsDNA分子不同的脈沖信號(hào)，從而能夠在單分子水平上測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子（RepE）與dsDNA的相互作用[18]。α-溶血素是一種膜結(jié)合蛋白，通過(guò)自組裝可在細(xì)胞的雙層磷脂膜上形成跨膜納米孔[20]。1996年， α-溶血素納米孔首次被用于單個(gè)DNA分子的電流脈沖檢測(cè)，是目前應(yīng)用最為廣泛的生物蛋白孔，其cis端直徑為2.6 nm，trans端直徑為2.2 nm，中間收縮區(qū)直徑為1.4 nm，因尺度限制僅容許單鏈DNA、RNA和一些多肽的通過(guò)。

魚(yú)精蛋白是一種分子量較小（由30～50個(gè)氨基酸組成）的多肽[21]，主要由精氨酸組成，是典型的堿性蛋白。在食品工業(yè)及生物醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用廣泛[22，23]。單個(gè)納米孔道的電化學(xué)空間限域效應(yīng)放大了生物分子間的弱相互作用， 可實(shí)現(xiàn)單個(gè)生物分子微小構(gòu)型變化的超靈敏檢測(cè)[24～27]。魚(yú)精蛋白能與DNA緊密地結(jié)合從而使精子中的遺傳物質(zhì)高度濃縮而停止轉(zhuǎn)錄。本研究基于超微電流放大器，利用α-HL生物納米孔界面對(duì)魚(yú)精蛋白以及魚(yú)精蛋白與ssDNA的相互作用的電流脈沖特征進(jìn)行了考察。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

DFCA-001超高靈敏度電流放大器（華東理工大學(xué)研制）[28]；CHEM HS Spare Headstage，N=1（美國(guó)Dagan Corporation）；NI-USB 6216數(shù)據(jù)采集板卡（美國(guó)國(guó)家儀器有限公司）；檢測(cè)池（孔徑150 μm， 美國(guó)Warner Instruments公司）；PB-10型pH計(jì)，Sartorius BS-110s型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16GB臺(tái)式高速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

三（羥甲基）氨基甲烷（﹥99.0%）、凍干α-溶血素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）； 1，2-二植烷?；字–HCl3溶液，美國(guó)Avanti Polar Lipids公司）； 正癸烷（﹥99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； HCl（分析純，沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠）； KCl（﹥99.8%，優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 乙二胺四乙酸（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）； 魚(yú)精蛋白（北京索萊寶生物科技有限公司）； Poly（dC）50、Poly（dC）30、Poly（dC）20、Poly（dA）20、Poly（dT）20（上海生物工程股份有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 α-溶血素雙分子膜的形成 所用電流脈沖檢測(cè)界面示意圖如圖1A所示。先用潔凈的貂毛筆刷在檢測(cè)池微米孔的兩側(cè)涂覆磷脂正癸烷溶液，將cis檢測(cè)池和trans檢測(cè)池組裝后，分別加入1 mL緩沖儲(chǔ)備液（pH=8.0，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L KCl），用提拉法形成磷脂雙分子層膜。通過(guò)Ag/AgCl向磷脂雙分子層膜兩端施加+100 mV電壓（cis端接地），在cis端微孔處注入2.5 μL 1.25 μg/mL α-溶血素并在磷脂雙分子層膜上自組裝形成一個(gè)穩(wěn)定的納米通道。電流從0 pA階躍到約100 pA時(shí)，表明單個(gè)α-溶血素蛋白通道自組裝成功。

2.2.2 信號(hào)采集與處理 將待測(cè)分子加在cis端，產(chǎn)生的電流脈沖信號(hào)先經(jīng)CHEM HS Headstage前置放大器轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)（增益0.1 mV/pA）后，再經(jīng)DFCA-001放大器放大（帶寬為5 kHz，增益10 mV/pA）。預(yù)處理的模擬信號(hào)以100 kHz的采樣頻率經(jīng)NI-USB 6216數(shù)據(jù)板卡進(jìn)行采集和記錄。所得數(shù)據(jù)通過(guò)LabVIEW程序?qū)崟r(shí)觀測(cè)并記錄，用Origin 8.5數(shù)據(jù)軟件和華東理工大學(xué)開(kāi)發(fā)的MATLAB軟件對(duì)單個(gè)納米孔阻塞信號(hào)進(jìn)行識(shí)別和處理[29]。

3.2 魚(yú)精蛋白與ssDNA相互作用的脈沖變化

將帶負(fù)電的ssDNA加到cis端，并在trans端施加正電壓，對(duì)其穿孔引起的電流脈沖進(jìn)行檢測(cè)。而在相同條件下，帶正電的魚(yú)精蛋白只有加在trans端才可觀測(cè)到脈沖（圖2A）。在+100 mV電壓下，魚(yú)精蛋白從trans端到cis端的電流脈沖信號(hào)如圖2D所示，圖2G為典型脈沖放大圖。由此可見(jiàn)，魚(yú)精蛋白也可從trans端通過(guò)界面，并產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的脈沖信號(hào)。Poly（dC）50帶負(fù)電荷，在同樣的電壓偏置下，從cis端穿越到trans端產(chǎn)生電流脈沖信號(hào)（圖2B），對(duì)應(yīng)的電流脈沖及典型放大圖如圖2E和圖2H所示。為了觀測(cè)poly（dC）50與魚(yú)精蛋白相互作用引起的電流脈沖變化，預(yù)先將魚(yú)精蛋白分子與poly（dC）50以濃度比10∶1充分混合后，加入到cis端（圖2C），在相同電壓偏置條件下，觀測(cè)到的電流脈沖及典型放大圖（圖2F和圖2I）。綜合以上結(jié)果可知，由于魚(yú)精蛋白和poly（dC）50電性相反，產(chǎn)生脈沖信號(hào)的條件及脈沖形態(tài)均有很大不同。二者相互作用后仍觀測(cè)到脈沖，表明復(fù)合的結(jié)果未改變poly（dC）50的電性。但是其脈沖的特征發(fā)生了顯著性改變，脈沖幅度（△I）及停留時(shí)間（toff）均增大（圖2H和圖2I）。圖3及表1為如上3種情況下電流脈沖信號(hào)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。由于魚(yú)精蛋白與ssDNA的作用，ssDNA的脈沖的停留時(shí)間和脈沖深度均有顯著增加，這可能與魚(yú)精蛋白與ssDNA作用后導(dǎo)致的分子尺度的增大和有效電荷的減少有關(guān)。

3.3 魚(yú)精蛋白與不同鏈長(zhǎng)ssDNA的相互作用

如圖4和表2的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，poly（dC）20-protamine復(fù)合物與poly（dC）20阻斷時(shí)間相比，前者的阻斷時(shí)間明顯增加，而二者阻斷電流深度相差不大。Poly（dC）30-protamine復(fù)合體與poly（dC）30的阻斷時(shí)間相差不大，阻斷電流深度增大，并且長(zhǎng)阻斷脈沖數(shù)明顯增多。 Protamine-poly（dC）50復(fù)合體與poly（dC）50相比，阻斷時(shí)間與阻斷電流均增大約1倍。由此可知，魚(yú)精蛋白與不同鏈長(zhǎng)的ssDNA作用有提高不同鏈長(zhǎng)同種堿基ssDNA的脈沖幅度分辨的能力，但停留時(shí)間與鏈長(zhǎng)缺乏相關(guān)性。

3.4 魚(yú)精蛋白與不同種類ssDNA相互作用

為了研究相同鏈長(zhǎng)不同堿基的ssDNA與魚(yú)精蛋白形成的復(fù)合物的穿孔行為變化，用等堿基數(shù)的poly（dA）20、poly（dT）20、poly（dC）20進(jìn)行了測(cè)試。poly（dA）20與Poly（dA）20-protamine復(fù)合體相比，二者的阻斷時(shí)間相差不大，但是長(zhǎng)阻斷脈沖的出現(xiàn)的頻率明顯增多（圖5A），復(fù)合物的阻斷電流比明顯增加。

4 結(jié) 論

基于非商品化超微微電流放大器建立的電流脈沖檢測(cè)系統(tǒng)，采用野生型α-溶血素單個(gè)納米孔界面，探究了魚(yú)精蛋白用于調(diào)控ssDNA電流脈沖的方法。結(jié)果表明，本系統(tǒng)不僅能夠分別檢測(cè)魚(yú)精蛋白和ssDNA的脈沖信號(hào)，而且二者的相互作用可以明顯改變ssDNA的電流脈沖信號(hào)。 ssDNA與魚(yú)精蛋白相互作用的結(jié)果使得ssDNA的電流脈沖停留時(shí)間和阻斷電流均有明顯增加。因此，基于帶正電的魚(yú)精蛋白與ssDNA的相互作用可能成為調(diào)控其電流脈沖的一種有效手段。

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