王華杰 劉元敏 李光宇 吳志勇

摘 要 單個納米孔電流脈沖法是一種新型、快速、簡便的檢測手段，有望實現(xiàn)單分子核酸測序和生物傳感。由于通常條件下分子穿孔導致的電流脈沖時間短，電流水平低，對脈沖檢測系統(tǒng)提出了很高的要求。本研究基于自行組建的單個納米孔電流脈沖檢測系統(tǒng)，以單個α-溶血素（α-HL）納米孔為界面，探究了魚精蛋白在調(diào)控ssDNA電流脈沖中的作用。結(jié)果表明，此系統(tǒng)不僅能夠分別觀測帶正電的魚精蛋白和帶負電的ssDNA探針的電流脈沖信號，而且加入魚精蛋白，可使ssDNA電流脈沖的幅度及停留時間均顯著增加。本研究為基于分子相互作用提高電流脈沖的分辨能力提供了途徑。

關(guān)鍵詞 α-溶血素； 魚精蛋白； 單鏈DNA； 相互作用

1 引 言

蛋白質(zhì)可作為活化劑或抑制劑識別核酸不同堿基位點并與其結(jié)合，從而可以調(diào)節(jié)細胞功能。通常研究蛋白質(zhì)-DNA復合物的方法包括電泳遷移率法[1]、核酸酶足跡法[2]、蛋白結(jié)合微陣列法[3]、表面等離子共振法[4]、染色質(zhì)免疫沉淀法[5]等。此外還有單分子技術(shù)（SM），如原子力顯微鏡（AFM）[6]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移[7]、光鑷子[8]和磁鑷子[9]。當生物分子穿過單個納米孔道時，可產(chǎn)生特征的電流脈沖信號，可用于單分子檢測[10]。該方法具有無需標記、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點，在DNA測序方面展現(xiàn)出良好的應用前景。該方法還可用于分析多種目標組分，如RNA[11]、多肽[12]、蛋白質(zhì)[13]、聚合物[14]、納米粒子[15]、金屬離子[16，17]等，以及在單分子水平上研究生物分子相互作用以及構(gòu)象變化[18]。DNA分子與其它分子通過相互作用形成復合物后，能夠產(chǎn)生特異性的電流脈沖信號[19]。如轉(zhuǎn)錄因子（RepE）與帶有前導寡鏈核苷酸的dsDNA作用形成復合物，進入α-溶血素納米通道，產(chǎn)生與帶有前導寡鏈核苷酸的dsDNA分子不同的脈沖信號，從而能夠在單分子水平上測定轉(zhuǎn)錄因子（RepE）與dsDNA的相互作用[18]。α-溶血素是一種膜結(jié)合蛋白，通過自組裝可在細胞的雙層磷脂膜上形成跨膜納米孔[20]。1996年， α-溶血素納米孔首次被用于單個DNA分子的電流脈沖檢測，是目前應用最為廣泛的生物蛋白孔，其cis端直徑為2.6 nm，trans端直徑為2.2 nm，中間收縮區(qū)直徑為1.4 nm，因尺度限制僅容許單鏈DNA、RNA和一些多肽的通過。

魚精蛋白是一種分子量較?。ㄓ?0～50個氨基酸組成）的多肽[21]，主要由精氨酸組成，是典型的堿性蛋白。在食品工業(yè)及生物醫(yī)學方面應用廣泛[22，23]。單個納米孔道的電化學空間限域效應放大了生物分子間的弱相互作用， 可實現(xiàn)單個生物分子微小構(gòu)型變化的超靈敏檢測[24～27]。魚精蛋白能與DNA緊密地結(jié)合從而使精子中的遺傳物質(zhì)高度濃縮而停止轉(zhuǎn)錄。本研究基于超微電流放大器，利用α-HL生物納米孔界面對魚精蛋白以及魚精蛋白與ssDNA的相互作用的電流脈沖特征進行了考察。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

DFCA-001超高靈敏度電流放大器（華東理工大學研制）[28]；CHEM HS Spare Headstage，N=1（美國Dagan Corporation）；NI-USB 6216數(shù)據(jù)采集板卡（美國國家儀器有限公司）；檢測池（孔徑150 μm， 美國Warner Instruments公司）；PB-10型pH計，Sartorius BS-110s型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；TGL-16GB臺式高速離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

三（羥甲基）氨基甲烷（﹥99.0%）、凍干α-溶血素（美國Sigma-Aldrich公司）； 1，2-二植烷?；字–HCl3溶液，美國Avanti Polar Lipids公司）； 正癸烷（﹥99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； HCl（分析純，沈陽化學試劑廠）； KCl（﹥99.8%，優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）； 乙二胺四乙酸（分析純，天津大茂化學試劑廠）； 魚精蛋白（北京索萊寶生物科技有限公司）； Poly（dC）50、Poly（dC）30、Poly（dC）20、Poly（dA）20、Poly（dT）20（上海生物工程股份有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 α-溶血素雙分子膜的形成 所用電流脈沖檢測界面示意圖如圖1A所示。先用潔凈的貂毛筆刷在檢測池微米孔的兩側(cè)涂覆磷脂正癸烷溶液，將cis檢測池和trans檢測池組裝后，分別加入1 mL緩沖儲備液（pH=8.0，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L KCl），用提拉法形成磷脂雙分子層膜。通過Ag/AgCl向磷脂雙分子層膜兩端施加+100 mV電壓（cis端接地），在cis端微孔處注入2.5 μL 1.25 μg/mL α-溶血素并在磷脂雙分子層膜上自組裝形成一個穩(wěn)定的納米通道。電流從0 pA階躍到約100 pA時，表明單個α-溶血素蛋白通道自組裝成功。

2.2.2 信號采集與處理 將待測分子加在cis端，產(chǎn)生的電流脈沖信號先經(jīng)CHEM HS Headstage前置放大器轉(zhuǎn)化為電壓信號（增益0.1 mV/pA）后，再經(jīng)DFCA-001放大器放大（帶寬為5 kHz，增益10 mV/pA）。預處理的模擬信號以100 kHz的采樣頻率經(jīng)NI-USB 6216數(shù)據(jù)板卡進行采集和記錄。所得數(shù)據(jù)通過LabVIEW程序?qū)崟r觀測并記錄，用Origin 8.5數(shù)據(jù)軟件和華東理工大學開發(fā)的MATLAB軟件對單個納米孔阻塞信號進行識別和處理[29]。

3.2 魚精蛋白與ssDNA相互作用的脈沖變化

將帶負電的ssDNA加到cis端，并在trans端施加正電壓，對其穿孔引起的電流脈沖進行檢測。而在相同條件下，帶正電的魚精蛋白只有加在trans端才可觀測到脈沖（圖2A）。在+100 mV電壓下，魚精蛋白從trans端到cis端的電流脈沖信號如圖2D所示，圖2G為典型脈沖放大圖。由此可見，魚精蛋白也可從trans端通過界面，并產(chǎn)生對應的脈沖信號。Poly（dC）50帶負電荷，在同樣的電壓偏置下，從cis端穿越到trans端產(chǎn)生電流脈沖信號（圖2B），對應的電流脈沖及典型放大圖如圖2E和圖2H所示。為了觀測poly（dC）50與魚精蛋白相互作用引起的電流脈沖變化，預先將魚精蛋白分子與poly（dC）50以濃度比10∶1充分混合后，加入到cis端（圖2C），在相同電壓偏置條件下，觀測到的電流脈沖及典型放大圖（圖2F和圖2I）。綜合以上結(jié)果可知，由于魚精蛋白和poly（dC）50電性相反，產(chǎn)生脈沖信號的條件及脈沖形態(tài)均有很大不同。二者相互作用后仍觀測到脈沖，表明復合的結(jié)果未改變poly（dC）50的電性。但是其脈沖的特征發(fā)生了顯著性改變，脈沖幅度（△I）及停留時間（toff）均增大（圖2H和圖2I）。圖3及表1為如上3種情況下電流脈沖信號的統(tǒng)計結(jié)果。由于魚精蛋白與ssDNA的作用，ssDNA的脈沖的停留時間和脈沖深度均有顯著增加，這可能與魚精蛋白與ssDNA作用后導致的分子尺度的增大和有效電荷的減少有關(guān)。

3.3 魚精蛋白與不同鏈長ssDNA的相互作用

如圖4和表2的統(tǒng)計結(jié)果顯示，poly（dC）20-protamine復合物與poly（dC）20阻斷時間相比，前者的阻斷時間明顯增加，而二者阻斷電流深度相差不大。Poly（dC）30-protamine復合體與poly（dC）30的阻斷時間相差不大，阻斷電流深度增大，并且長阻斷脈沖數(shù)明顯增多。 Protamine-poly（dC）50復合體與poly（dC）50相比，阻斷時間與阻斷電流均增大約1倍。由此可知，魚精蛋白與不同鏈長的ssDNA作用有提高不同鏈長同種堿基ssDNA的脈沖幅度分辨的能力，但停留時間與鏈長缺乏相關(guān)性。

3.4 魚精蛋白與不同種類ssDNA相互作用

為了研究相同鏈長不同堿基的ssDNA與魚精蛋白形成的復合物的穿孔行為變化，用等堿基數(shù)的poly（dA）20、poly（dT）20、poly（dC）20進行了測試。poly（dA）20與Poly（dA）20-protamine復合體相比，二者的阻斷時間相差不大，但是長阻斷脈沖的出現(xiàn)的頻率明顯增多（圖5A），復合物的阻斷電流比明顯增加。

4 結(jié) 論

基于非商品化超微微電流放大器建立的電流脈沖檢測系統(tǒng)，采用野生型α-溶血素單個納米孔界面，探究了魚精蛋白用于調(diào)控ssDNA電流脈沖的方法。結(jié)果表明，本系統(tǒng)不僅能夠分別檢測魚精蛋白和ssDNA的脈沖信號，而且二者的相互作用可以明顯改變ssDNA的電流脈沖信號。 ssDNA與魚精蛋白相互作用的結(jié)果使得ssDNA的電流脈沖停留時間和阻斷電流均有明顯增加。因此，基于帶正電的魚精蛋白與ssDNA的相互作用可能成為調(diào)控其電流脈沖的一種有效手段。

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