李鳳娟 魏蘇寧 王綠婭 徐國恒

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)目前已成為我國慢性肝病的重要病因[1-2]。當(dāng)女性絕經(jīng)后，脂肪肝的發(fā)病率增高[1-2]。流行病學(xué)、臨床和動物實驗研究均揭示雌激素具有抵抗脂肪肝發(fā)生的作用。脂肪肝病理變化是肝實質(zhì)細胞內(nèi)脂滴 (lipid droplet)形成和儲積，近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂滴包被蛋白Perilipin 2 (Plin2) 可以促進肝細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累，在肝臟脂質(zhì)代謝中具有重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。而雌激素是否通過影響Plin2而抑制脂肪肝發(fā)生尚未見報道。本文通過建立油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性模型，研究雌激素對脂滴包被蛋白Plin2的作用，旨在為為圍絕經(jīng)期女性非酒精性脂肪肝防治提供新的實驗依據(jù)。

材料與方法

1.細胞系 人肝癌細胞HepG2細胞株購自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。

2.主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶購自廈門星隆達化學(xué)試劑有限公司；油酸購自德國 Calbiochem 公司；尼羅紅染料購自美國Sigma公司；羊抗鼠 Plin 2 抗體由美國國立衛(wèi)生研究院Constantine Londos 教授惠贈；兔抗 EIF5 抗體購自美國Santa Cruz公司。白蛋白結(jié)合的油酸制備：將2.8g不含脂肪酸的BSA溶于20 mL 100mmol/LTris-Cl(pH 8.0)中，向上述溶液中加入78 μL,37 ℃預(yù)熱的油酸液體；溶解后將其過濾除菌得到澄清的油酸儲存液(12.5 mmol/L)；油酸儲存液按1:31(v/v)用培養(yǎng)基稀釋即得到0.4 mmol/L油酸誘導(dǎo)工作液，可直接用來刺激細胞內(nèi)TG蓄積。

3.油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性模型建立 HepG2 細胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。將 1cm x 1cm 的玻片放入 24 孔培養(yǎng)板，取對數(shù)生長期的 HepG2 細胞種植于 24 孔培養(yǎng)板，制作細胞爬片。細胞種植 24 h 后，加入終濃度為 0.4mmol/L油酸誘導(dǎo)工作液培養(yǎng) 48 h，誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性，尼羅紅染色法進行染色[5]，鏡下觀察拍照(Eclipse 50i 型顯微鏡，日本 Nikon 公司)。

4.雌激素對肝細胞脂肪變性的影響 按上訴 “3”方法建立肝細胞脂肪變性模型，設(shè)置 DMSO 對照組、油酸模型組、油酸+不同濃度雌激素(1 nmol、10 nmol、100 nmol 和 1 μmol)的實驗組，處理 48 h，尼羅紅染色法進行染色，鏡下觀察拍照。

5.Plin2 免疫熒光染色 建立肝細胞脂肪變性模型，設(shè)置 DMSO 對照組、油酸模型組、油酸+雌激素(1μm)的實驗組，處理 48 h 后，進行 Plin2 免疫熒光染色，PBS 洗滌細胞 2 次，4%多聚甲醛室溫固定15min；PBS洗滌3次，加入透膜液(10% Triton X-100)室溫孵育10 min；PBS洗兩次后，加入封閉液封閉10 min；PBS洗1次，加入一抗稀釋液，4 ℃孵育16～18 min；PBS洗3次，二抗稀釋液孵育，室溫避光輕搖 1 h；移去二抗稀釋液，加入Hoechst染液復(fù)染核，室溫孵育10 min；PBS輕柔流洗3次，抗熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察拍照。

6.蛋白免疫印跡實驗 建立肝細胞脂肪變性模型，設(shè)置DMSO對照組、油酸模型組、油酸+雌激素(1μm)的實驗組，處理48 h后，PBS洗滌細胞2次。加入適量細胞裂解液，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管置冰上，反復(fù)劇烈振蕩解裂解細胞，BCA法測定蛋白質(zhì)含量。進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%牛奶封閉液封閉30 min，加入一抗 Plin2(1∶1 000)和EIF5 單抗(1∶10 000)，4℃ 孵育過夜(EIF5 單抗室溫孵育60 min)，TBST緩沖液(0.05% Tween20 的 TBS 緩沖液)洗膜10 min ×3次，1∶5 000 稀釋 HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育 60 min，TBST緩沖液洗膜10 min ×3次，膠片發(fā)光，掃描分析。

7.統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計作圖。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用多法重復(fù)方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性模型建立 HepG2 細胞經(jīng)過油酸誘導(dǎo)后能夠很好的呈現(xiàn)出細胞內(nèi)脂肪沉積的特征。細胞內(nèi)的脂滴主要分布在細胞質(zhì)靠近細胞膜的部位。尼羅紅染色可見脂滴呈高亮的橘紅色點狀或片狀分布，而不經(jīng)油酸誘導(dǎo)的DMSO對照則不能生成任何脂滴，說明油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性模型建立成功。見圖1。

圖1 油酸誘導(dǎo)HepG2細胞脂肪變性的模型建立(×400) DMSO: 二甲基 亞砜; OA: 油酸(0.4 mmol)

2.雌激素減少油酸誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性 成功建立油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性模型后，在加入油酸的同時加入不同濃度的雌激素，觀察雌激素對肝細胞脂肪變性的影響。結(jié)果顯示雌激素能夠濃度依賴性的降低肝細胞內(nèi)的脂肪變性，脂滴的數(shù)量逐漸減少，甚至消失。當(dāng)雌激素濃度為1 μmol 時，抑制效果最為顯著。見圖2。

3.免疫熒光檢測雌激素對Plin2表達的影響 利用已建立的油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性模型，在加入油酸的同時加入1 μm的雌激素，通過免疫熒光染色觀察雌激素對Plin2蛋白表達的影響。染色結(jié)果顯示，油酸處理能夠顯著性的增加Plin2的蛋白表達，綠色熒光信號增強，當(dāng)加入雌激素后，能夠降低Plin2的蛋白表達水平，綠色熒光信號明顯減弱。見圖3。

圖2 雌激素減少油酸誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性(尼羅紅染色，×400倍) 注：DMSO:對照組、油酸模型組(OA：0.4mmol/L)、油酸+不同濃度雌激素(E2) 1 nm、10 nm、100 nm 和 1 μm 的實驗組。

4.蛋白免疫印跡檢測雌激素對Plin2蛋白表達的影響 為了進一步明確雌激素對Plin2蛋白表達的影響，分別收取了DMSO對照組、油酸模型組和油酸加1 μm雌激素實驗組的細胞，進行了蛋白免疫印跡實驗。結(jié)果顯示Plin2的蛋白表達水平在油酸的誘導(dǎo)下顯著升高，加入雌激素后能夠抑制油酸誘導(dǎo)的Plin2的增加。DMSO對照組、油酸誘導(dǎo)模型組和雌激素實驗組Plin2蛋白表達相對光密度分別為0.409 ± 0.051、0.739 ± 0.060和0.438 ± 0.061，雌激素顯著性減少了油酸誘導(dǎo)的Plin2的蛋白表達水平(P<0.05，圖4)。

討 論

脂肪肝已經(jīng)成為引起慢性肝病和心血管相關(guān)疾病的重要因素之一[6]。正常情況下肝臟內(nèi)脂肪酸的獲取和輸出處于平衡狀態(tài)，當(dāng)肝臟脂肪酸獲取增多而輸出受阻時便會引起脂肪肝[7]。目前有關(guān)雌激素抑制脂肪肝發(fā)生機制的研究主要集中在影響脂質(zhì)合成和輸出兩個方面。

女性絕經(jīng)后，卵巢停止產(chǎn)生雌激素，雌激素水平顯著降低，發(fā)生高血脂、胰島素抵抗、脂肪肝等癥狀[8-9]。絕經(jīng)后女性患脂肪肝的概率增加，是絕經(jīng)前女性的兩倍，給予絕經(jīng)后女性進行雌激素替代治療后，其發(fā)生脂肪肝的概率明顯下降[10]。Lin 等發(fā)現(xiàn)，小鼠卵巢切除后脂質(zhì)從頭合成的關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的表達明顯增加，肝臟內(nèi)TG含量上升，而給予雌激素后ACC的表達下降，TG水平也降低，減少了脂肪肝的發(fā)生[11]。雌激素也可通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子PPARδ及其下游靶基因，促進脂肪酸的氧化，減少肝臟中脂質(zhì)的積累[12]。由此可見，雌激素可以通過抑制脂質(zhì)合成途徑或是促進脂質(zhì)輸出途徑來減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)的含量。

圖3 免疫熒光檢測雌激素對Plin2表達的影響 注：DMSO:對照組、油酸模型組(OA：0.4mmol/L)、油酸+雌激素(E2)1 μm 的實驗組，Plin2 免疫熒 光染色(綠色熒光信號),分別為(×200)和(×400)

圖4 蛋白免疫印跡檢測雌激素對Plin2蛋白表達的影響 注：A：蛋白免疫印跡實驗檢測在DMSO對照組、 油酸模型組和油酸+雌激素實驗組Plin2蛋白表達水平。B：Plin2相對于EIF5的光密度，注：* P<0.05

脂肪肝最基本的病理變化是肝實質(zhì)細胞內(nèi)脂滴的形成和儲積。近年來，脂滴包被蛋白(Perilipin)家族相繼被發(fā)現(xiàn)，它們在脂肪代謝過程中發(fā)揮重要作用，其中Plin2廣泛表達于各種組織。已有文獻報道Plin2可以促進細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。外源性過表達Plin2可以促進成纖維細胞內(nèi)脂滴的形成和積累[13]；在肝臟細胞中過表達Plin2，TG含量也增多[14]。此外，Plin2基因敲除小鼠與正常小鼠相比，高脂飲食后，肝臟TG的水平下降約60%，并且能夠抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝產(chǎn)生[15]。而本研究則發(fā)現(xiàn)雌激素能夠降低Plin2的蛋白表達水平，減少肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。

綜上所述，本文成功建立油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性的模型，發(fā)現(xiàn)雌激素可能通過抑制Plin2的蛋白表達從而減少肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。本文為圍絕經(jīng)期女性非酒精性脂肪肝防治的研究奠定實驗基礎(chǔ)。