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        傅里葉變換紅外光譜和紫外光譜數(shù)據(jù)融合對牛肝菌種類的鑒別

        2018-10-31 00:52:22劉鴻高李杰慶王元忠
        食品科學 2018年20期
        關(guān)鍵詞:牛肝菌種類正確率

        姚 森,劉鴻高,李 濤,李杰慶,*,王元忠*

        (1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院,云南 昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,云南 昆明 650221;3.玉溪師范學院資源環(huán)境學院,云南 玉溪 653100;4.云南省省級中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務中心,云南 昆明 650200)

        云南是我國牛肝菌種類最豐富的地區(qū)之一,已知牛肝菌224 種,其中可食用牛肝菌144 種[4]。牛肝菌種類繁多,形態(tài)相似,采用傳統(tǒng)方法觀察鑒別難度大,因誤采誤食造成中毒事件時有發(fā)生[5],目前對快速、有效鑒別牛肝菌種類的研究較少,同時市場上對食用牛肝菌分類模糊,以次充好的現(xiàn)象屢見不鮮。李艷春等[6]研究了市場上4“種”常見牛肝菌的DNA條形碼,結(jié)果表明4“種”牛肝菌樣品代表了12 個物種;Dentinger等[7]對超市購買的中國云南出口美味牛肝菌進行DNA測序分析,發(fā)現(xiàn)同一包裝袋內(nèi)15 片牛肝菌中有3 種新牛肝菌物種?,F(xiàn)今,市場上的欺詐行為嚴重威脅消費者健康,損害消費者利益,擾亂食用菌市場。準確鑒別野生牛肝菌是保障消費者安全,維護人民利益,進一步開發(fā)利用和加強市場質(zhì)量監(jiān)控的重要前提。

        目前,食用菌鑒別分類研究主要集中在光譜法和分子生物學方法。Moha?ek-Gro?ev等[8]采集30 個不同屬野生菌的紅外光譜,對光譜信息進行解析,結(jié)果顯示不同野生菌樣品的紅外光譜差異明顯,其中1 200~1 000 cm-1的差異可以作為不同屬野生菌的特征區(qū)。楊天偉等[9]采用紫外光譜(ultraviolet spectroscopy,UV)技術(shù)結(jié)合主成分分析對不同產(chǎn)地、種類可食用牛肝菌進行研究,結(jié)果表明其紫外圖譜具有指紋特性,主成分分析顯示不同種類牛肝菌對營養(yǎng)成分積累有明顯差異,可以用于鑒別不同產(chǎn)地、種類食用牛肝菌。Mello等[10]根據(jù)ITS片段設(shè)計引物,采用分子生物學方法成功鑒別銅色牛肝菌(Boletus aereus Bull.)和美味牛肝菌(B. edulis Bull.)。單一的光譜法對樣品有效信息提取率低,容易受到各個因素(如溫度、濕度、CO2濃度、溶劑等)影響;分子生物學方法費用昂貴,操作復雜,不適合推廣應用。

        數(shù)據(jù)融合是將多個來源信息加以過濾、優(yōu)化、整合,得到更加準確、可靠的數(shù)據(jù)信息,其目的是通過各儀器間協(xié)同作用,獲得比單一技術(shù)更準確的分類結(jié)果[11-12],已被廣泛應用于食品、飲料的鑒別和質(zhì)量評價等領(lǐng)域[13-16]。數(shù)據(jù)融合分為低級融合、中級融合和高級融合,低級數(shù)據(jù)融合是將不同儀器獲得的數(shù)據(jù)進行簡單的串聯(lián),形成更全面的數(shù)據(jù)集[17];中級融合是將不同來源的數(shù)據(jù)經(jīng)過特征提取,并對選取特征變量(如主成分)進行整合,去除干擾信息,從而獲得更加豐富、系統(tǒng)的數(shù)據(jù)集[18-19];高級融合為決策級融合,結(jié)合兩個或兩個以上分類模型得出最佳鑒別結(jié)果[20]。目前,大多數(shù)學者采用低級或中級融合技術(shù),僅10%的研究采用高級融合技術(shù)[21]。在本實驗中,中級融合分類正確率已經(jīng)達到100%,因此不對高級融合進行深入的研究分析。

        本研究采用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)TIR)法和UV法,具有花費低、速度快、靈敏度高、可靠性強等優(yōu)點[22-23]。采用二階導數(shù)(second derivative,2D)、多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)、數(shù)據(jù)融合等方法優(yōu)化樣品信息,通過偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)和支持向量機(support vector machine,SVM)比較FTIR、UV、低級融合和中級融合技術(shù)對不同種牛肝菌的分類效果,快速及有效鑒別野生食用菌,為加強市場監(jiān)控提供理論基礎(chǔ)與科學依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        實驗所用5 個不同種類牛肝菌(皺蓋疣柄牛肝菌、栗色牛肝菌、小美牛肝菌、美味牛肝菌和雙色牛肝菌)均采自云南省,共272 份樣品,樣品詳細信息見表1。

        表1 牛肝菌樣品信息Table 1 Information about boletes samples

        KBr 天津市風船化學試劑科技有限公司;氯仿云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司。所有化學試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Frontier型FTIR儀(配備硫酸三甘肽晶體氘化檢測器,掃描范圍為4 000~400 cm-1,掃描信號累加16 次,分辨率為4 cm-1) 美國Perkin Elmer公司;UV-2550型紫外-可見分光光度計(掃描范圍190~600 nm,狹縫寬度1 nm) 日本島津公司;SY3200-T型超聲波清洗儀(功率150 W,頻率55 kHz) 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司;YP-2型壓片機 上海市山岳科學儀器有限公司;FW-100型高速粉碎機 天津市華鑫儀器廠;80目標準篩盤 浙江上虞市道墟五四儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 FTIR采集

        田卓聽完匯報也很興奮,鼓勵大家再努力一把,爭取在兩個月之內(nèi),就給這個活動畫上一個完美的句號。臨散會的時候,田卓還專門安排高潮說,高先生,你該提前做新的項目策劃了。從田卓的話音里,高潮可以感覺出她對自己的策劃能力認可了,心里的興奮又陡增了幾分。

        樣品采集后清洗干凈,50 ℃烘干,粉碎后過80 目標準篩,備用。按1∶100的比例,準確稱量(1.5±0.2)mg牛肝菌樣品和(150±20)mg溴化鉀粉末,放入瑪瑙研缽充分混合研磨成細粉,將細粉倒入壓制磨具中壓制成片。將FTIR儀預熱30 min后進行FTIR掃描,樣品重復測定2 次,取平均光譜;掃描前使用空白樣本扣除CO2和H2O的干擾。

        1.3.2 UV采集

        稱?。?.1±0.002)g牛肝菌樣品粉末置于石英比色皿中,加入10 mL氯仿溶劑,超聲提取30 min,三層濾紙過濾,取清液備用。紫外-可見分光光度計預熱30 min后測定樣品UV,重復掃描2 次,取平均光譜,掃描間隔1 nm。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        FTIR儀和紫外-可見分光光度計在采集光譜信息時,會夾雜背景噪音、散光等干擾信息。為消除干擾信息,紅外原始光譜通過OMNIC 8.0軟件進行平均光譜、自動基線校正、平滑、縱坐標歸一化等預處理,紫外原始光譜采用UV probe 2.34軟件進行平滑等預處理;同時,采用2D+MSC對FTIR和UV分別進行優(yōu)化處理。

        原始光譜經(jīng)預處理后,選取具有指紋特性的原始光譜數(shù)據(jù)進行串聯(lián),形成一個包含大量變量的獨立數(shù)據(jù)矩陣,完成低級融合。采用SIMCA-P+13.0軟件對FTIR和UV數(shù)據(jù)分別進行PLS-DA,提取主成分并整合,進行中級融合。

        SIMCA-P+13.0軟件對光譜數(shù)據(jù)進行2D、MSC優(yōu)化處理,Origin 8.0軟件作圖,通過SIMCA-P+13.0軟件和MATLAB R2014a軟件分別進行PLS-DA和SVM分析,建立判別模型,比較分類結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 原始FTIR檢測結(jié)果

        釆用OMNIC 8.0軟件對272 份牛肝菌FTIR進行平滑、基線校正和縱坐標歸一化等預處理。選取牛肝菌FTIR特征吸收峰的集中波段在2 000~400 cm-1內(nèi),用于區(qū)分牛肝菌種類。如圖1所示,不同種類牛肝菌的FTIR較為相似,共有峰波數(shù)大致相同,在1 634、1 480、1 400、1 319、1 253、1 078、1 057 cm-1等波數(shù)附近有明顯吸收峰,但不同種牛肝菌樣品吸收峰的強度有差異。1 634 cm-1附近吸收峰為C=O伸縮振動,為蛋白質(zhì)酰胺I帶;1 480 cm-1附近歸屬為亞甲基的彎曲振動;1 400、1 319、1 253 cm-1等附近為多糖、蛋白質(zhì)等的C—O—H彎曲振動和亞甲基的變形振動;1 078、1 057 cm-1附近分別為糖類的C—O和C—C伸縮振動;950~710 cm-1波段有多個弱吸收峰,主要為糖類異構(gòu)體的特征峰[24-25]。

        圖1 5 種牛肝菌的FTIRFig. 1 IR spectra of fi ve boletus species

        2.2 原始紫外圖譜分析

        在采集樣品UV過程中,容易受到溶劑、儀器、環(huán)境等干擾,采用UV probe 2.34軟件對牛肝菌樣品進行平滑等預處理。由于在190~230 nm波長內(nèi)UV受干擾嚴重,且400 nm以后無明顯特征吸收峰,牛肝菌UV的特征吸收峰集中在230~400 nm波長范圍內(nèi),因此選取230~400 nm波長范圍的171 個變量作為樣品信息用于區(qū)分牛肝菌種類。如圖2所示,在240~400 nm范圍內(nèi)5 種牛肝菌樣品光譜圖峰形相似度高,在250~350 nm區(qū)間有明顯的特征吸收峰,274、285、296 nm附近為樣品共有峰,表明不同種牛肝菌的化學組分相似;5 種牛肝菌樣品的峰強、峰位和峰面積存在差異,尤其在230~240 nm區(qū)間差異明顯,具有指紋特性,能夠作為區(qū)分不同種類牛肝菌的依據(jù)。

        圖2 5 種牛肝菌的UVFig. 2 UV spectra of fi ve boletus species

        2.3 主成分提取

        采用PLS-DA提取主成分,R2Y表示主成分累計貢獻率,貢獻率越高代表樣品信息越多;Q2表示主成分對樣品的預測能力,Q2越大表示預測能力越強[26]。如圖3所示,當Q2達到最大值時,F(xiàn)TIR前16 個主成分累計貢獻率達90.35%,UV前30 個主成分累計貢獻率達74.86%,能夠代表樣品的主要信息。將兩種光譜數(shù)據(jù)的主成分組合在一起,進行中級融合,形成新的數(shù)據(jù)集為進一步鑒別分析做準備。

        圖3 PLS-DA提取主成分得分圖Fig. 3 Scores plots for principal components extracted by PLS-DA

        2.4 PLS-DA結(jié)果

        PLS-DA是基于偏最小二乘回歸的一種有監(jiān)督的判別分類方法,利用自變量矩陣X和分類變量Y建立回歸模型,通過PLS預測未知樣品類別的方法[27-28]。采用PLS-DA比較預處理對分類效果的影響。圖4顯示,經(jīng)過預處理后FTIR較UV對不同種牛肝菌的區(qū)分效果更好;經(jīng)過預處理后的區(qū)分效果優(yōu)于原始的效果,表明2D和MSC預處理對FTIR和UV的優(yōu)化效果較好。

        圖4 不同種牛肝菌PLS-DA得分圖Fig. 4 Scores plot for PLS-DA of different species of bolete mushrooms

        隨機選取90 個樣品(約樣品量的1/3)作為預測集,其余182 個樣品作為訓練集。對FTIR、UV、低級融合和中級融合數(shù)據(jù)分別建立PLS-DA判別模型。如表2所示,F(xiàn)TIR技術(shù)與UV技術(shù)相比,F(xiàn)TIR判別模型具有更高的準確度,表明FTIR結(jié)合PLS-DA建立判別模型對未知樣品的分類更加準確。低級數(shù)據(jù)融合技術(shù)對不同種牛肝菌的分類正確率高于UV技術(shù),低于FTIR技術(shù),表明低級融合豐富了光譜數(shù)據(jù),同時簡單的數(shù)據(jù)串聯(lián)將無效信息相互疊加,降低分類正確率。結(jié)果與Roussel等[29]的結(jié)論一致,受干擾信息影響,不是所有情況下數(shù)據(jù)融合得到的結(jié)果都優(yōu)于單獨儀器。同時,中級數(shù)據(jù)融合訓練集和預測集的正確率分別達到98.90%和95.56%,正確率高于單一光譜技術(shù),分類效果優(yōu)于低級融合,表明中級融合技術(shù)在融合過程中去除了大量干擾信息,能夠建立更穩(wěn)定、可靠的判別模型。

        表2 PLS-DA對不同數(shù)據(jù)集的分類結(jié)果Table 2 Results of PLS-DA of different data matrixes

        2.5 SVM

        SVM是基于統(tǒng)計學習理論的模式識別方法,主要應用于模式識別領(lǐng)域,能夠解決小樣本、非線性和高維數(shù)等問題,有效防止過擬合現(xiàn)象[30-31],該方法已被廣泛應用于原材料鑒別、食品分析等方面[32-34]。SVM模型選取訓練集和預測集的方法同2.4節(jié),采用網(wǎng)格搜索法篩選建模的最佳參數(shù),基于FTIR、UV、低級融合和中級融合數(shù)據(jù)分別建立SVM判別模型。如圖5所示,UV技術(shù)分類錯誤最多,中級融合全部分類正確,表明中級融合對牛肝菌種類的鑒別效果最佳。

        圖5 SVM對測試集的實際分類和預測分類圖Fig. 5 Plots of actual and predicted categories of test samples by SVM

        表3 SVM對不同數(shù)據(jù)集的分類結(jié)果Table 3 Results of SVM of different data matrixes

        如表3所示,4 個數(shù)據(jù)集建模穩(wěn)定性依次為中級融合>低級融合>FTIR>UV。同時低級融合對樣品的預測正確率高于單個技術(shù),表明低級融合數(shù)據(jù)比單個儀器數(shù)據(jù)更全面,判別效果更好;中級融合的分類正確率高于低級融合,證明中級融合在整合數(shù)據(jù)過程中去除了無效信息,避免兩種光譜信息的互相干擾,提高分類正確率。該結(jié)論與Biancolillo等[19]研究結(jié)果相吻合,多種光譜技術(shù)對食品進行鑒別分析,低級和中級數(shù)據(jù)融合區(qū)分效果皆高于單一光譜技術(shù),并且中級數(shù)據(jù)融合優(yōu)于低級數(shù)據(jù)融合。比較表2和表3可知,采用中級融合技術(shù)建立SVM判別模型,模型穩(wěn)定、可靠,對不同種牛肝菌鑒別效果最佳。

        3 結(jié) 論

        采用FTIR法和UV法采集云南地區(qū)常見牛肝菌物種的光譜信息,選擇MSC和2D分別對牛肝菌FTIR和UV進行優(yōu)化處理。優(yōu)化后的光譜數(shù)據(jù)進行PLS-DA,結(jié)果顯示同種類牛肝菌樣品能較好地聚集在一起,部分不同種類牛肝菌樣品混在一起,難以區(qū)分;表明優(yōu)化處理對牛肝菌種類區(qū)分效果優(yōu)于原始光譜,且FTIR對不同種牛肝菌的區(qū)分效果優(yōu)于UV。

        采用低級和中級數(shù)據(jù)融合策略對兩種光譜數(shù)據(jù)進行融合,通過PLS-DA和SVM建立分類鑒別模型,并比較FTIR、UV、低級融合和中級融合技術(shù)對不同種牛肝菌鑒別效果。結(jié)果顯示:中級數(shù)據(jù)融合建立的SVM判別模型預測正確率分別為95.56%和100.00%,高于其他模型,表明中級融合對不同種牛肝菌區(qū)分效果最佳,且SVM建立分類模型更穩(wěn)定、可靠。中級融合技術(shù)結(jié)合SVM建立鑒別模型,能夠準確、有效區(qū)分不同種牛肝菌,為快速鑒別野生食用菌提供有效方法,對維護食用菌市場的穩(wěn)定具有重要意義。

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