姚 森，劉鴻高，李 濤，李杰慶,*，王元忠*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650221；3.玉溪師范學院資源環(huán)境學院，云南 玉溪 653100；4.云南省省級中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務中心，云南 昆明 650200）

云南是我國牛肝菌種類最豐富的地區(qū)之一，已知牛肝菌224 種，其中可食用牛肝菌144 種[4]。牛肝菌種類繁多，形態(tài)相似，采用傳統(tǒng)方法觀察鑒別難度大，因誤采誤食造成中毒事件時有發(fā)生[5]，目前對快速、有效鑒別牛肝菌種類的研究較少，同時市場上對食用牛肝菌分類模糊，以次充好的現(xiàn)象屢見不鮮。李艷春等[6]研究了市場上4“種”常見牛肝菌的DNA條形碼，結(jié)果表明4“種”牛肝菌樣品代表了12 個物種；Dentinger等[7]對超市購買的中國云南出口美味牛肝菌進行DNA測序分析，發(fā)現(xiàn)同一包裝袋內(nèi)15 片牛肝菌中有3 種新牛肝菌物種?，F(xiàn)今，市場上的欺詐行為嚴重威脅消費者健康，損害消費者利益，擾亂食用菌市場。準確鑒別野生牛肝菌是保障消費者安全，維護人民利益，進一步開發(fā)利用和加強市場質(zhì)量監(jiān)控的重要前提。

目前，食用菌鑒別分類研究主要集中在光譜法和分子生物學方法。Moha?ek-Gro?ev等[8]采集30 個不同屬野生菌的紅外光譜，對光譜信息進行解析，結(jié)果顯示不同野生菌樣品的紅外光譜差異明顯，其中1 200～1 000 cm-1的差異可以作為不同屬野生菌的特征區(qū)。楊天偉等[9]采用紫外光譜（ultraviolet spectroscopy，UV）技術(shù)結(jié)合主成分分析對不同產(chǎn)地、種類可食用牛肝菌進行研究，結(jié)果表明其紫外圖譜具有指紋特性，主成分分析顯示不同種類牛肝菌對營養(yǎng)成分積累有明顯差異，可以用于鑒別不同產(chǎn)地、種類食用牛肝菌。Mello等[10]根據(jù)ITS片段設(shè)計引物，采用分子生物學方法成功鑒別銅色牛肝菌（Boletus aereus Bull.）和美味牛肝菌（B. edulis Bull.）。單一的光譜法對樣品有效信息提取率低，容易受到各個因素（如溫度、濕度、CO2濃度、溶劑等）影響；分子生物學方法費用昂貴，操作復雜，不適合推廣應用。

數(shù)據(jù)融合是將多個來源信息加以過濾、優(yōu)化、整合，得到更加準確、可靠的數(shù)據(jù)信息，其目的是通過各儀器間協(xié)同作用，獲得比單一技術(shù)更準確的分類結(jié)果[11-12]，已被廣泛應用于食品、飲料的鑒別和質(zhì)量評價等領(lǐng)域[13-16]。數(shù)據(jù)融合分為低級融合、中級融合和高級融合，低級數(shù)據(jù)融合是將不同儀器獲得的數(shù)據(jù)進行簡單的串聯(lián)，形成更全面的數(shù)據(jù)集[17]；中級融合是將不同來源的數(shù)據(jù)經(jīng)過特征提取，并對選取特征變量（如主成分）進行整合，去除干擾信息，從而獲得更加豐富、系統(tǒng)的數(shù)據(jù)集[18-19]；高級融合為決策級融合，結(jié)合兩個或兩個以上分類模型得出最佳鑒別結(jié)果[20]。目前，大多數(shù)學者采用低級或中級融合技術(shù)，僅10%的研究采用高級融合技術(shù)[21]。在本實驗中，中級融合分類正確率已經(jīng)達到100%，因此不對高級融合進行深入的研究分析。

本研究采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）法和UV法，具有花費低、速度快、靈敏度高、可靠性強等優(yōu)點[22-23]。采用二階導數(shù)（second derivative，2D）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、數(shù)據(jù)融合等方法優(yōu)化樣品信息，通過偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和支持向量機（support vector machine，SVM）比較FTIR、UV、低級融合和中級融合技術(shù)對不同種牛肝菌的分類效果，快速及有效鑒別野生食用菌，為加強市場監(jiān)控提供理論基礎(chǔ)與科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用5 個不同種類牛肝菌（皺蓋疣柄牛肝菌、栗色牛肝菌、小美牛肝菌、美味牛肝菌和雙色牛肝菌）均采自云南省，共272 份樣品，樣品詳細信息見表1。

表1 牛肝菌樣品信息Table 1 Information about boletes samples

KBr 天津市風船化學試劑科技有限公司；氯仿云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司。所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Frontier型FTIR儀（配備硫酸三甘肽晶體氘化檢測器，掃描范圍為4 000～400 cm-1，掃描信號累加16 次，分辨率為4 cm-1） 美國Perkin Elmer公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計（掃描范圍190～600 nm，狹縫寬度1 nm） 日本島津公司；SY3200-T型超聲波清洗儀（功率150 W，頻率55 kHz） 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；YP-2型壓片機 上海市山岳科學儀器有限公司；FW-100型高速粉碎機 天津市華鑫儀器廠；80目標準篩盤 浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 FTIR采集

田卓聽完匯報也很興奮，鼓勵大家再努力一把，爭取在兩個月之內(nèi)，就給這個活動畫上一個完美的句號。臨散會的時候，田卓還專門安排高潮說，高先生，你該提前做新的項目策劃了。從田卓的話音里，高潮可以感覺出她對自己的策劃能力認可了，心里的興奮又陡增了幾分。

樣品采集后清洗干凈，50 ℃烘干，粉碎后過80 目標準篩，備用。按1∶100的比例，準確稱量（1.5±0.2）mg牛肝菌樣品和（150±20）mg溴化鉀粉末，放入瑪瑙研缽充分混合研磨成細粉，將細粉倒入壓制磨具中壓制成片。將FTIR儀預熱30 min后進行FTIR掃描，樣品重復測定2 次，取平均光譜；掃描前使用空白樣本扣除CO2和H2O的干擾。

1.3.2 UV采集

稱?。?.1±0.002）g牛肝菌樣品粉末置于石英比色皿中，加入10 mL氯仿溶劑，超聲提取30 min，三層濾紙過濾，取清液備用。紫外-可見分光光度計預熱30 min后測定樣品UV，重復掃描2 次，取平均光譜，掃描間隔1 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

FTIR儀和紫外-可見分光光度計在采集光譜信息時，會夾雜背景噪音、散光等干擾信息。為消除干擾信息，紅外原始光譜通過OMNIC 8.0軟件進行平均光譜、自動基線校正、平滑、縱坐標歸一化等預處理，紫外原始光譜采用UV probe 2.34軟件進行平滑等預處理；同時，采用2D+MSC對FTIR和UV分別進行優(yōu)化處理。

原始光譜經(jīng)預處理后，選取具有指紋特性的原始光譜數(shù)據(jù)進行串聯(lián)，形成一個包含大量變量的獨立數(shù)據(jù)矩陣，完成低級融合。采用SIMCA-P+13.0軟件對FTIR和UV數(shù)據(jù)分別進行PLS-DA，提取主成分并整合，進行中級融合。

SIMCA-P+13.0軟件對光譜數(shù)據(jù)進行2D、MSC優(yōu)化處理，Origin 8.0軟件作圖，通過SIMCA-P+13.0軟件和MATLAB R2014a軟件分別進行PLS-DA和SVM分析，建立判別模型，比較分類結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始FTIR檢測結(jié)果

釆用OMNIC 8.0軟件對272 份牛肝菌FTIR進行平滑、基線校正和縱坐標歸一化等預處理。選取牛肝菌FTIR特征吸收峰的集中波段在2 000～400 cm-1內(nèi)，用于區(qū)分牛肝菌種類。如圖1所示，不同種類牛肝菌的FTIR較為相似，共有峰波數(shù)大致相同，在1 634、1 480、1 400、1 319、1 253、1 078、1 057 cm-1等波數(shù)附近有明顯吸收峰，但不同種牛肝菌樣品吸收峰的強度有差異。1 634 cm-1附近吸收峰為C＝O伸縮振動，為蛋白質(zhì)酰胺I帶；1 480 cm-1附近歸屬為亞甲基的彎曲振動；1 400、1 319、1 253 cm-1等附近為多糖、蛋白質(zhì)等的C—O—H彎曲振動和亞甲基的變形振動；1 078、1 057 cm-1附近分別為糖類的C—O和C—C伸縮振動；950～710 cm-1波段有多個弱吸收峰，主要為糖類異構(gòu)體的特征峰[24-25]。

圖1 5 種牛肝菌的FTIRFig. 1 IR spectra of fi ve boletus species

2.2 原始紫外圖譜分析

在采集樣品UV過程中，容易受到溶劑、儀器、環(huán)境等干擾，采用UV probe 2.34軟件對牛肝菌樣品進行平滑等預處理。由于在190～230 nm波長內(nèi)UV受干擾嚴重，且400 nm以后無明顯特征吸收峰，牛肝菌UV的特征吸收峰集中在230～400 nm波長范圍內(nèi)，因此選取230～400 nm波長范圍的171 個變量作為樣品信息用于區(qū)分牛肝菌種類。如圖2所示，在240～400 nm范圍內(nèi)5 種牛肝菌樣品光譜圖峰形相似度高，在250～350 nm區(qū)間有明顯的特征吸收峰，274、285、296 nm附近為樣品共有峰，表明不同種牛肝菌的化學組分相似；5 種牛肝菌樣品的峰強、峰位和峰面積存在差異，尤其在230～240 nm區(qū)間差異明顯，具有指紋特性，能夠作為區(qū)分不同種類牛肝菌的依據(jù)。

圖2 5 種牛肝菌的UVFig. 2 UV spectra of fi ve boletus species

2.3 主成分提取

采用PLS-DA提取主成分，R2Y表示主成分累計貢獻率，貢獻率越高代表樣品信息越多；Q2表示主成分對樣品的預測能力，Q2越大表示預測能力越強[26]。如圖3所示，當Q2達到最大值時，F(xiàn)TIR前16 個主成分累計貢獻率達90.35%，UV前30 個主成分累計貢獻率達74.86%，能夠代表樣品的主要信息。將兩種光譜數(shù)據(jù)的主成分組合在一起，進行中級融合，形成新的數(shù)據(jù)集為進一步鑒別分析做準備。

圖3 PLS-DA提取主成分得分圖Fig. 3 Scores plots for principal components extracted by PLS-DA

2.4 PLS-DA結(jié)果

PLS-DA是基于偏最小二乘回歸的一種有監(jiān)督的判別分類方法，利用自變量矩陣X和分類變量Y建立回歸模型，通過PLS預測未知樣品類別的方法[27-28]。采用PLS-DA比較預處理對分類效果的影響。圖4顯示，經(jīng)過預處理后FTIR較UV對不同種牛肝菌的區(qū)分效果更好；經(jīng)過預處理后的區(qū)分效果優(yōu)于原始的效果，表明2D和MSC預處理對FTIR和UV的優(yōu)化效果較好。

圖4 不同種牛肝菌PLS-DA得分圖Fig. 4 Scores plot for PLS-DA of different species of bolete mushrooms

隨機選取90 個樣品（約樣品量的1/3）作為預測集，其余182 個樣品作為訓練集。對FTIR、UV、低級融合和中級融合數(shù)據(jù)分別建立PLS-DA判別模型。如表2所示，F(xiàn)TIR技術(shù)與UV技術(shù)相比，F(xiàn)TIR判別模型具有更高的準確度，表明FTIR結(jié)合PLS-DA建立判別模型對未知樣品的分類更加準確。低級數(shù)據(jù)融合技術(shù)對不同種牛肝菌的分類正確率高于UV技術(shù)，低于FTIR技術(shù)，表明低級融合豐富了光譜數(shù)據(jù)，同時簡單的數(shù)據(jù)串聯(lián)將無效信息相互疊加，降低分類正確率。結(jié)果與Roussel等[29]的結(jié)論一致，受干擾信息影響，不是所有情況下數(shù)據(jù)融合得到的結(jié)果都優(yōu)于單獨儀器。同時，中級數(shù)據(jù)融合訓練集和預測集的正確率分別達到98.90%和95.56%，正確率高于單一光譜技術(shù)，分類效果優(yōu)于低級融合，表明中級融合技術(shù)在融合過程中去除了大量干擾信息，能夠建立更穩(wěn)定、可靠的判別模型。

表2 PLS-DA對不同數(shù)據(jù)集的分類結(jié)果Table 2 Results of PLS-DA of different data matrixes

2.5 SVM

SVM是基于統(tǒng)計學習理論的模式識別方法，主要應用于模式識別領(lǐng)域，能夠解決小樣本、非線性和高維數(shù)等問題，有效防止過擬合現(xiàn)象[30-31]，該方法已被廣泛應用于原材料鑒別、食品分析等方面[32-34]。SVM模型選取訓練集和預測集的方法同2.4節(jié)，采用網(wǎng)格搜索法篩選建模的最佳參數(shù)，基于FTIR、UV、低級融合和中級融合數(shù)據(jù)分別建立SVM判別模型。如圖5所示，UV技術(shù)分類錯誤最多，中級融合全部分類正確，表明中級融合對牛肝菌種類的鑒別效果最佳。

圖5 SVM對測試集的實際分類和預測分類圖Fig. 5 Plots of actual and predicted categories of test samples by SVM

表3 SVM對不同數(shù)據(jù)集的分類結(jié)果Table 3 Results of SVM of different data matrixes

如表3所示，4 個數(shù)據(jù)集建模穩(wěn)定性依次為中級融合＞低級融合＞FTIR＞UV。同時低級融合對樣品的預測正確率高于單個技術(shù)，表明低級融合數(shù)據(jù)比單個儀器數(shù)據(jù)更全面，判別效果更好；中級融合的分類正確率高于低級融合，證明中級融合在整合數(shù)據(jù)過程中去除了無效信息，避免兩種光譜信息的互相干擾，提高分類正確率。該結(jié)論與Biancolillo等[19]研究結(jié)果相吻合，多種光譜技術(shù)對食品進行鑒別分析，低級和中級數(shù)據(jù)融合區(qū)分效果皆高于單一光譜技術(shù)，并且中級數(shù)據(jù)融合優(yōu)于低級數(shù)據(jù)融合。比較表2和表3可知，采用中級融合技術(shù)建立SVM判別模型，模型穩(wěn)定、可靠，對不同種牛肝菌鑒別效果最佳。

3 結(jié) 論

采用FTIR法和UV法采集云南地區(qū)常見牛肝菌物種的光譜信息，選擇MSC和2D分別對牛肝菌FTIR和UV進行優(yōu)化處理。優(yōu)化后的光譜數(shù)據(jù)進行PLS-DA，結(jié)果顯示同種類牛肝菌樣品能較好地聚集在一起，部分不同種類牛肝菌樣品混在一起，難以區(qū)分；表明優(yōu)化處理對牛肝菌種類區(qū)分效果優(yōu)于原始光譜，且FTIR對不同種牛肝菌的區(qū)分效果優(yōu)于UV。

采用低級和中級數(shù)據(jù)融合策略對兩種光譜數(shù)據(jù)進行融合，通過PLS-DA和SVM建立分類鑒別模型，并比較FTIR、UV、低級融合和中級融合技術(shù)對不同種牛肝菌鑒別效果。結(jié)果顯示：中級數(shù)據(jù)融合建立的SVM判別模型預測正確率分別為95.56%和100.00%，高于其他模型，表明中級融合對不同種牛肝菌區(qū)分效果最佳，且SVM建立分類模型更穩(wěn)定、可靠。中級融合技術(shù)結(jié)合SVM建立鑒別模型，能夠準確、有效區(qū)分不同種牛肝菌，為快速鑒別野生食用菌提供有效方法，對維護食用菌市場的穩(wěn)定具有重要意義。