王盼盼，李穗霞，曾 琪，周陸紅，張鵬飛，王 新,*

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)學院，北京 100083）

涼皮是陜西地區(qū)深受人們喜愛的即食食品之一，其入口爽滑、風味獨特，一年四季皆宜食用。涼皮制作工藝簡單，主要以普通面粉為原料，經(jīng)和面、洗面后，保留面水進行二次過濾處理，再取適量面水于平底容器中隔沸水煮3～4 min，室溫晾涼即可調(diào)制食用。在整個過程中，涼皮與從業(yè)人員接觸頻率極高，且食用前不需要進行熱處理[1-2]。如果相關(guān)行業(yè)標準不明確、操作管理不規(guī)范，涼皮、涼拌菜、速凍食品等食物極易被致病微生物污染，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）便是其中之一[2]。已有報道表明，在速凍米面制品、熟肉制品、涼拌菜等即食食品中常有金黃色葡萄球菌檢出[3-5]。

金黃色葡萄球菌是自然界中極為常見的致病微生物之一，大約20%～30%的人口是金黃色葡萄球菌攜帶者[6]。不管是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在整個細菌性食物中毒中均占有較大比例[7]。金黃色葡萄球菌引起食物中毒的主要原因是其可在食物中產(chǎn)生腸毒素，主要癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉及腹絞痛[8-9]。現(xiàn)已報道的金黃色葡萄球菌腸毒素種類有24 種，其中包含19 種已經(jīng)動物實驗證明可產(chǎn)生催吐作用的腸毒素（SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SES、SET）和5 種尚待證實可產(chǎn)生催吐作用的腸毒素（SE1J、SE1U2、SE1V、SE1X、SE1Y）[10]。

在檢測爆發(fā)型流行病及相關(guān)致病因子時，金黃色葡萄球菌A蛋白（Staphylococcus pvotein A，SPA）分型方法得以廣泛應用[11]。SPA是由Fc結(jié)合區(qū)域、X區(qū)域及C末端3 部分組成，其中X區(qū)域由可變數(shù)量的24 bp重復序列組成，呈現(xiàn)基因多態(tài)性，據(jù)此建立分型方法即SPA分型[12-14]。此外，由于抗生素濫用，致病微生物多呈現(xiàn)耐藥性，金黃色葡萄球菌便是其中之一，典型代表為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[15]。一旦爆發(fā)由食品安全事件，相關(guān)致病菌較高的耐藥性將給治療帶來難度。因此，對食源性金黃色葡萄球菌進行持續(xù)調(diào)查與耐藥特征分析顯得尤為重要。

為研究陜西特色小吃——涼皮中的金黃色葡萄球菌污染情況及其流行現(xiàn)狀，本實驗以陜西省楊凌地區(qū)為基點，選擇連鎖超市、學校餐廳、小餐館、流動攤點4 種常見銷售渠道，進行為期一年的定點跟蹤采樣。對金黃色葡萄球菌檢測陽性樣本中進行腸毒素基因檢測、SPA分型及耐藥特征分析，為該地區(qū)涼皮安全控制與監(jiān)測提供科學依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株與標準菌株

實驗所用涼皮樣品由本實驗室采集，對樣品進行處理，最終分離得到105 株金黃色葡萄球菌用于實驗，由本實驗室保存；標準菌株大腸埃希氏菌（ATCC25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC29213），由中國食品藥品檢定研究院惠贈。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂、Baird-Parker瓊脂、亞碲酸鹽卵黃增菌液北京陸橋技術(shù)股份有限責任公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）用Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、dNTPs、Mg2+、DL2000 DNA Marker和引物 大連寶生物公司；藥敏實驗所用14 種抗生素：紅霉素（erythromycin，Ery）、青霉素（penicillin，Pen）、頭孢西?。╟efoxitin，Cefox）、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、阿莫西林/克拉維酸（amoxicillin/clavulanic acid，A/C）、苯唑西林（oxacillin，Oxa）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，Cip）、利福平（rifampin，Rif）、萬古霉素（vancomycin，Van）、四環(huán)素（tetracycline，Tet）、氯霉素（chloramphenicol，Chl）、頭孢哌酮（cefoperazone，Cefop）、阿米卡星（amikacin，Amk）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（trimethoprim/sulfamethoxazole，T/S） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mycircle PCR基因擴增儀、GEL DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司；NU-425-400E超凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Milli-Q Synthesis超純水機德國默克密理博公司；微量移液槍 德國艾本德股份公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；MDF-U5411高壓滅菌鍋 上海申安高壓儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

采集陜西省楊凌區(qū)市售涼皮為實驗樣本，2015年3月—2016年3月進行跟蹤采樣。采樣地點包括連鎖超市、學校餐廳、小餐館、流動攤點4 種銷售渠道，選取分散于楊陵區(qū)各方位的12 個銷售點，共采集涼皮樣本432 個。

1.3.2 樣本處理

根據(jù)GB 4789.10—2010《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》方法。稱取25 g樣品至盛有225 mL 0.9%的無菌生理鹽水中，均質(zhì)。用1 mL微量移液槍吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中，充分混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。選擇2 個適宜稀釋度的樣品勻液，在進行10 倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液，以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加入3 個Baird-Parker平板，然后用無菌L棒涂布整個平板，37 ℃培養(yǎng)適宜時間后，挑選典型菌落至甘露醇氯化鈉平板再次培養(yǎng)篩選后，進行保菌。最后，通過PCR擴增金黃色葡萄球菌特異性基因nuc進行再次確認陽性菌株。

1.3.3 基因組提取

用滅菌后的棉簽蘸取胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)菌落，轉(zhuǎn)移至裝有1 000 μL滅菌蒸餾水的1.5 mL離心管中，振蕩混勻。煮沸20 min后，置于離心機內(nèi)，在12 000 r/min離心5 min[16]，然后取上清液，密封于滅菌離心管內(nèi)，于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR擴增與引物設(shè)計

PCR體系共25 μL，其中包括滅菌水15.775 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、MgCl21.5 μL、TaKaRa Taq酶0.125 μL、引物（上游引物，下游引物）各0.3 μL，DNA提取物2.5 μL。PCR條件和引物設(shè)計根據(jù)相關(guān)參考文獻執(zhí)行（表1），引物由大連寶生物公司合成。

1.3.5 spa測序分型

s p a測序分型所使用引物序列根據(jù)網(wǎng)站（http://www.seqnet.org/）提供：spa-1113f（5’-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’），spa-1514r（5’-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3’）。測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成，運用Ridom Staph 軟件（Ridom Gmb, Würzburg，Germany）對測序結(jié)果進行聚類分析。

1.3.6 藥敏實驗

采用臨床和實驗室標準協(xié)會推薦的瓊脂稀釋法測定抗生素對供試菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MlCs），確定14 種抗生素耐藥表型。具體使用藥物為：Pen、Amp、Oxa、Ery、Tet、Cefox、Cefop、Chl、Cip、Rif、Van、Amk、T/S、A/C。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌計數(shù)及檢出率

本研究涼皮樣本采集時間為2015年3月—2016年3月，針對所采集的432 份樣本進行金黃色葡萄球菌的分離檢測，其中105 份呈陽性，總檢出率為24.3%（105/432）。對105 份陽性樣本進行金黃色葡萄球菌計數(shù)，根據(jù)銷售渠道、采樣時間不同，選取12個采樣點每月金黃色葡萄球菌計數(shù)結(jié)果最大值進行統(tǒng)計分析。如表2所示，涼皮中所含金黃色葡萄球菌數(shù)量分布于0.1～3.1（lg（CFU/g）），計數(shù)值最高點落于5月份從小餐館采得的樣品。計數(shù)結(jié)果中，分布于1.0～2.0（lg（CFU/g））水平的樣本最多，且大都來自于流動攤點和小餐館兩種銷售渠道。

對105 份樣本進行金黃色葡萄球菌檢出率結(jié)果統(tǒng)計，4 種銷售渠道中，從連鎖超市采得的涼皮金黃色葡萄球菌檢出率最高為44.4%（16/36），流動攤點以31.5%（34/108）檢出率次之，小餐館檢出率為21.0%（53/252），而學校餐廳的樣本檢出率最低為5.6%（2/36）。

表2 不同銷售渠道金黃色葡萄球菌計數(shù)Table 2 Counts of S. aureus in cold noodle samples from different distribution channels

圖1 不同季度金黃色葡萄球菌檢出率Fig. 1 Detection rate of S. aureus in different quarters

根據(jù)季度對采集樣本分析，4 個季度中均有金黃色葡萄球菌檢出。如圖1所示，對比各銷售渠道的不同季度檢出率，除學校餐廳，其他3 種渠道均是第2、3季度金黃色葡萄球菌檢出率最高，這與已有報道所示結(jié)果——由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒多發(fā)于夏秋季節(jié)吻合[20-22]。綜合統(tǒng)計4 個季度中的金黃色葡萄球菌檢出率，第2季度金黃色葡萄球菌檢出率最高為38.0%（41/108），第3季度以32.4%（35/108）的檢出率次之，第4季度檢出率13.9%（15/108）與第1季度檢出率為13.0%（14/108）相對較低。

2.2 腸毒素基因檢出率

由攜帶sea、seb、sec、sed、see基因的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占金黃色葡萄球菌食物中毒的95%[3]，另有報道表明，越來越多不同類別食物中有新型腸毒素基因seg、seh、sei、sej的檢出[23]。故本研究選擇這9 種腸毒素基因進行檢測，各銷售渠道腸毒素基因檢出結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，105 株金黃色葡萄球菌的腸毒素基因攜帶率高達100%（105/105）。9 種腸毒素基因中，sea檢出率最高為96.2%（101/105），see次之為64.8%（68/105），還有部分seb和sec檢出，檢出率分別為54.3%（57/105）和49.5%（52/105），seh檢出率為1.0%（1/105），sed、seg、sei、sej的檢出率則均為0.0%（0/105）。對于4 種銷售渠道，連鎖超市菌株主要攜帶sea（93.8%，12 /16）和seb（75.0%，12/16），流動攤點和小餐館則主要攜帶sea（97.1%，33/34；96.2%，51/53）和see（67.6%，23/34；64.2%，34/53）。此外，這些菌株攜帶2 種及其以上腸毒素基因的概率較高，為90.5%（95/105）。攜帶3 種腸毒素基因概率相對較高為37.1%（39/105），同時攜帶4 種腸毒素基因的概率為19.0%（20/105），且其腸毒素基因表型為sea-seb-sec-see。

表3 腸毒素基因檢出結(jié)果Table 3 Results of detection of enterotoxin genes

2.3 耐藥性檢測結(jié)果（多重（n≥3））

隨著抗性藥物的廣泛應用，金黃色葡萄球菌的耐藥性發(fā)生了很大變化。本研究對分離自涼皮的105 株金黃色葡萄球菌進行14 種常見藥物的耐受性檢測，所有菌株100.0%耐藥。如表4所示，14 種藥物中，金黃色葡萄球菌對青霉素類藥品——青霉素和葉酸代謝途徑抑制劑類藥品——T/S均100.0%耐藥，其次對氨芐西林（84.8%）和A/C（87.6%）有較高耐受率，對Ery（26.7%）和Cefox（24.8%）有一定耐受力，對Cefop、Cip、Amk和Van的耐受力最低均為0.0%。就藥物類別來說，研究樣本對青霉素類和四環(huán)素類藥物具有較高耐受性。

表4 涼皮中金黃色葡萄球菌的耐藥情況Table 4 Antimicrobial resistance profiles of S. aureus isolated from cold noodles

表5 金黃色葡萄球菌多重（n≥3）耐藥譜Table 5 Multi-antimicrobial resistance pro fi les of S. aureus isolates

統(tǒng)計分析樣本金黃色葡萄球菌的多重（n≥3）耐藥情況，如表5所示，105 株金黃色葡萄球菌至少耐受3 種藥物。其中，出現(xiàn)對4 種藥物具有耐受性的概率最高，為69.5%（73/105），且主要表型為耐受Pen-Amp-T/S-A/C（61.9%，65/105）。當藥品數(shù)目大于5 種（包含5 種）時，菌株的耐受率為29.5%（31/105）。研究還發(fā)現(xiàn)有3 株金黃色葡萄球菌耐藥數(shù)目高達7 種，它們均對Pen、Cefox、T/S和A/C耐藥，差異性體現(xiàn)在對Oxa、Ery和Rif的耐受性上。

2.4 SPA型檢測結(jié)果

圖2 105 株金黃色葡萄球菌的SPA型別Fig. 2 SPA types of 105 S. aureus isolates

對105 株金黃色葡萄球菌進行spa擴增，送樣檢測并分析SPA型別。如圖2所示，所檢樣本SPA型別主要以t701（81.9%，86/105）為主，其次為t441（16.2%，17/105），t127和t796占比最少（1.0%，1/105）。分析優(yōu)勢SPA型別t701和t441的腸毒素基因攜帶情況：t701主要攜帶sea（97.7%，84/86）和see（74.4%，64/86），sec（55.8%，48/86）和seb（46.5%，40/86）的攜帶率次之、t441的17株金黃色葡萄球菌100%攜帶腸毒素基因sea和seb，攜帶see的概率為23.5%（4/17），攜帶sec的概率為11.8%（2/17）。此外，這2 種SPA型別對于sed、seg、seh、sei、sej的攜帶率則均為0.0%。

3 討 論

本研究在陜西楊凌地區(qū)定點選取12 個采樣點，涵蓋連鎖超市（1 個）、流動攤點（3 個）、小餐館（7 個）和學校餐廳（1 個）4 種該地區(qū)人們常選擇的涼皮銷售渠道，進行為期1 a的涼皮跟蹤采樣監(jiān)測實驗。最終，采集涼皮樣本432 個，有金黃色葡萄球菌分離檢出的樣本為105 個，檢出率為24.3%。研究發(fā)現(xiàn)，楊凌區(qū)市售涼皮中金黃色葡萄球菌陽性樣本檢出多發(fā)生在夏秋季節(jié)，其中第2季度檢出率最高（38.0%），其次為第3季度（32.4%），第1季度（13.0%）、第4季度（13.9%）相對較低。金黃色葡萄球菌是典型的環(huán)境微生物之一，在37 ℃可穩(wěn)定生長，空氣、灰塵、人手上均有存在。第2、3季度屬夏秋季節(jié)，環(huán)境溫度相對較高，而涼皮在從餐廳至飯桌的過程中有較大機會與從業(yè)人員接觸，因此大大增加了涼皮被金黃色葡萄球菌污染的概率。在4 種銷售渠道中，連鎖超市的金黃色葡萄球菌檢出率最高（44.4%），流動攤點（31.5%）和小攤點（21.0%）的檢出率次之，學校餐廳的檢出率最低（5.6%）。

研究者走訪連鎖超市發(fā)現(xiàn)，涼皮在被購買前大量保藏在室溫環(huán)境，且在相應貨架上擱置時間較長（9：00～21：00），此存放環(huán)境適宜金黃色葡萄球菌生長。此外，超市人流量大，顧客隨意碰觸到?jīng)銎さ目赡苄愿撸@大大增加了涼皮被金黃色葡萄球菌污染的概率。一旦有少量金黃色葡萄球菌被帶入涼皮中，即可大量繁殖生長，嚴重者則會爆發(fā)食品安全事件。對于流動攤點銷售渠道，它們沒有固定的銷售地點，貯藏方式簡便且銷售環(huán)境多變，多數(shù)從業(yè)者甚至在不佩戴食品級一次性手套的情況下稱取涼皮，故涼皮被污染概率極高。相對流動攤點，小餐館的銷售環(huán)境較為良好，但依然存在餐具消毒不嚴格、從業(yè)人員未佩戴口罩和手套現(xiàn)象。因楊凌地區(qū)學生數(shù)量較大，故選擇某學校餐廳作為采樣點。研究者調(diào)研發(fā)現(xiàn)該校餐飲安全把控較為嚴格、操作相對規(guī)范，故所售賣的涼皮被污染概率最低。對比這4 種銷售渠道，人們有較大概率選擇在小餐館、流動攤點購食涼皮，連鎖超市也是選擇之一，而這3 種渠道所售涼皮均具有較高的金黃色葡萄球菌檢出率，這表明相關(guān)行業(yè)從在較高的食品安全隱患。

針對常見致病微生物進行耐藥性研究是現(xiàn)代食品安全檢測行業(yè)常做的項目之一，本研究針對105株金黃色葡萄球菌進行藥敏實驗。在研究選取的14 種常見藥品中，涵蓋10 種藥品類型，結(jié)果表明105 株金黃色葡萄球菌的耐藥率高達100%，且呈現(xiàn)多重（n≥3）趨勢。對于青霉素類、四環(huán)素類、葉酸代謝途徑抑制劑類和其他類（A/C）藥物具有較高耐受性，對于糖肽類的Van、大環(huán)內(nèi)脂類的Cip以及氟喹諾酮類的阿米卡星則均不具有耐受性。在分析多重（n≥3）耐藥結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，表型為Pen-Amp-T/S-A/C時105 株金黃色葡萄球菌的耐受率最高達61.9%，這4 種藥品中，有2 種（Pen和Amp）屬青霉素類藥物。

研究中的105 株金黃色葡萄球菌不僅具有較高耐藥性，還具有較高的腸毒素基因攜帶率。腸毒素是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的典型致病因子之一，具有較高的熱穩(wěn)定性，可在100 ℃煮沸30 min不被破壞，亦能抵抗胃腸道中蛋白酶的水解作用[24-25]。此外，腸毒素的產(chǎn)生與環(huán)境條件（如水分活度、酸堿度及溫度等）密切相關(guān)。研究表明，當環(huán)境溫度為37 ℃，水分活度大于0.85，酸堿度接近于0.74且氧氣和二氧化碳充分的條件下，金黃色葡萄球菌可保持較高的生長速度，產(chǎn)生大量的腸毒素[26]。涼皮制作通常在室溫（25 ℃）下即可進行，在此溫度下金黃色葡萄球菌亦可生長繁殖。同時，涼皮是以普通面粉為主要原料，經(jīng)過和面、洗面等前處理工序，將面水隔水蒸熟3～4 min左右制成。此加工過程并未有足夠且充分的殺菌、滅菌工序，而金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素一旦形成即使加熱充分也不能將其徹底消滅[27-28]，且廣泛引發(fā)食物中毒事件的A型腸毒素在酸堿度pH值大于4.5的情況下即可產(chǎn)生[29]，這大大增加了涼皮被金黃色葡萄球菌污染的概率。實際生活中，涼皮的銷售地點以小餐館為主，此途徑售賣的涼皮制品貯存十分簡便，通常在開放、未經(jīng)嚴格消毒處理的托盤中放置，僅有部分食品貯藏設(shè)施配備齊全的銷售點會采取低溫、封閉的貯藏方式，這大大增加了涼皮進入餐桌前被金黃色葡萄球菌污染的可能性。綜合涼皮的制作過程，一旦有金黃色葡萄球菌侵入制作涼皮原料或所使用器具，便極易快速生長繁殖，產(chǎn)生腸毒素，導致食品安全事件的發(fā)生。

本研究通過對分離所得的金黃色葡萄球菌株進行檢測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)所售涼皮含有的金黃色葡萄球菌攜帶腸毒素基因以sea（96.2%）最多，同時攜帶2 種及其以上腸毒素基因的概率高達90.5%，且主要以攜帶sea～see 5 種經(jīng)典腸毒素基因為主。事實上，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒多數(shù)是由腸毒素SEA所引起，而本研究中的金黃色葡萄球菌可編碼此蛋白的基因sea攜帶率又極高。研究對105株金黃色葡萄球菌進行SPA型別檢測，分析發(fā)現(xiàn)該地區(qū)金黃色葡萄球菌的SPA優(yōu)勢型別為t701（73.7%），其次還有部分t441（16.2%）?，F(xiàn)有報道表明，分離自陜西西安地區(qū)食物中毒的金黃色葡萄球菌其SPA型別為t701[30]。此外，t701是相關(guān)城市由金黃色葡萄球菌引起食物中毒的2 種SPA型別之一（另一種為t189）[31]。分析本研究中86 株t701金黃色葡萄球菌的sea～sei 9 種腸毒素基因攜帶情況：sea攜帶率最高為97.7%，see次之為74.4%，sec和seb相對較高分別為55.8%和46.5%，其余均為0.0%。

本研究針對楊凌4 種銷售渠道進行定點跟蹤檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)105 株金黃色葡萄球菌株的腸毒素基因、SPA分型結(jié)果具有較高穩(wěn)定性，具體表現(xiàn)在spa-t701及腸毒素基因sea、see的高檢出率。分析原因，其一是該種SPA型別可長期且較穩(wěn)定存在于陜西楊凌區(qū)涼皮食品中；其二是本研究選擇長期定點的采樣方式，所獲得樣本的檢測結(jié)果在一定程度上具有重復性；其三是陜西楊凌區(qū)覆蓋面積有限，檢測結(jié)果呈現(xiàn)相對穩(wěn)定性。